高效液相色譜法測定廣西粉葛中葛根素的含量

1、高效液相色譜法測定廣西粉葛中葛根素的含量               作者：楊立芳， 李小燕， 羅偉強， 潘洪平，鄧光輝, 韋冬萍【關(guān)鍵詞】  廣西粉葛；葛根素；高效液相色譜法摘要：目的采用HPLC法測定廣西粉葛中葛根素的含量。方法色譜柱Phenomenex Gemini C18柱（250 mm ×4.6 mm, 5 m）；流動相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30。

2、結(jié)果葛根素在8002400 ng范圍內(nèi)峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為A=7.682×104C +5.885×104，r=0.999 3（n=5）。其平均回收率為99.49，RSD為0.75(n=5)。結(jié)論該方法簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為廣西粉葛藥材質(zhì)量控制的有效方法。關(guān)鍵詞：廣西粉葛；  葛根素；  高效液相色譜法Determination of Puerarinin Content in Guangxi Radix puerariae thomsonii by HPLCAbstract：ObjectiveTo determine the c

3、ontent of puerarin from Guangxi Radix puerariae thomsonii by HPLC.Methods The isolation was conducted on a phenomenex gemini C18 column (250 rmm ×4.6 mm , 5 m ), the mobile phase consisted of acetonitnle (A)-0.4% phosphoric and (B) in a gradient model, the flow rate wes 1.0 ml/min, the detectio

4、n wavelength was 250 nm and the column temporature was 30.ResultsThe content of puerarin showed good linearity in the range of 800 ng2400 ng，the regression equation was A=7.682×104C +5.885×104，r=0.999 3 (n=5), and the average recovery was 99.49, RSD was 0.75% (n=5).ConclusionThis method is

5、 simple, rapid, accurate and reliable. It can be used for quality control of Guangxi Radix puerariae thomsonii.Key words：Radix puerariae thomsonii；  Puerarin；  HPLC   粉葛為豆科植物甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth)的干燥根。收載于中國藥典各版1。主含異黃酮成分葛根素(Puerarin)、葛根素木糖苷(Puerarinxyloside)、大豆黃酮（Daidzein）、

6、大豆黃酮苷（Daidzein）及多量淀粉等2，具有解肌退熱、生津、透疹、生陽止瀉之功效3。葛根素是粉葛藥材中的主要活性成分之一，具有擴張冠狀動脈，降低血壓，減少心肌耗氧量；抗心率失常；降血糖，降血脂；抗動脈硬化，改善微循環(huán)；抗腫瘤等多種藥理作用4。為此，粉葛越來越受到人們的重視。本文采用適宜的提取方法，通過HPLC法對廣西不同產(chǎn)地粉葛中葛根素進行含量測定，可較全面地評價廣西粉葛藥材質(zhì)量，為廣西粉葛藥材的開發(fā)和應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。1  儀器與試藥美國PerkinElmer  Series 200液相色譜儀；紫外檢測器；葛根素對照品(中國藥品生物制品鑒定所 批號：110752-

7、2004110)；乙腈為色譜純；水為超純水。其余試劑均為分析純。實驗所用粉葛藥材（產(chǎn)地：廣西）經(jīng)廣西南寧食品藥品檢驗所鑒定。2  方法與結(jié)果2.1  色譜條件色譜柱：Phenomenex  Gemini  C18柱（250 mm ×4.6 mm,5 m）；檢測波長：250 nm；柱溫：30；進樣量：20 l；理論板數(shù)按葛根素計算不低于5000。流動相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，流速：1.0 ml/min。采用梯度洗脫，程序：05 min A/B（0：100）；525 min A/B（11：89）；2540 min A/B（17：83

8、）；4050 min A/B（35：65）；5070 min A/B（78：22）。2.2  對照品溶液的制備精密稱取20 mg葛根素對照品，用30乙醇超聲5 min使溶解，定容至50 ml容量瓶中搖勻，即得(每毫升中含葛根素400g)。2.3  供試品溶液的制備取粉葛藥材粉末約1.0 g（過2號篩），精密稱定，精密加入30%乙醇溶液50 ml，稱定重量,用超聲清洗器進行超聲提取1 h，再次稱定重量, 用30%乙醇溶液補足減失的重量,然后減壓過濾，取出濾液，用0.45 m水系微孔濾膜過濾，得供試品溶液。2.4  系統(tǒng)適用性實驗在“21”項色譜條件下，葛根素與相鄰峰

9、可達到基線分離，分離度大于4.0，理論塔板數(shù)以葛根素計算為5000，色譜圖見圖1。2.5  線性關(guān)系考查精密稱取20 mg葛根素對照品，用30乙醇溶解（需超聲5 min），定容至50 ml容量瓶中制成貯備液。分別精確量取貯備液1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 ml定容至10 ml，制成葛根素含量為40.00，60.00，80.00，100.0，120.0gml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各進樣20 l，記錄峰面積積分值，以峰面積積分值A(chǔ)對濃度C進行回歸，得A=7.682×104C+5.885×104，r=0.9993（n=5）。表明葛根素在8002400 ng

10、范圍內(nèi)峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系。          2.6  精密度實驗精密吸取“25”項下的對照品溶液(80.00 mgL-1)20 l，連續(xù)進樣5次，測得色譜峰面積，計算RSD為0.47(n=5)。2.7  穩(wěn)定性實驗取3號樣品（批號：031030）,按“23”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣20 l,于0，2，5，17，24，42 h進樣測定，測得色譜峰面積，計算RSD為1.59(n=5)。結(jié)果表明,供試品溶液在42 h內(nèi)穩(wěn)定。圖1  粉葛藥材HPLC色譜圖（略）

11、2.8  重復(fù)性實驗取同一批粉葛藥材樣品（批號：031030）5份，分別精密稱定，按“23”項下方法配制供試品溶液，分別進樣20 l，測得色譜峰面積，計算葛根素的RSD為1.88(n=5)。2.9  回收率實驗取已知含量的同一批供試品(批號20051001) 5份，每份0.5 g，置50 ml容量瓶,精密稱定,分別精密加入葛根素對照品溶液(葛根素：400 gml-1) 5 ml，加入30%乙醇溶液適量，用超聲清洗器進行超聲提取1 h，放冷至室溫，用30%乙醇溶液定容,然后減壓過濾，取出濾液，用0.45 m水系微孔濾膜過濾，得供試品溶液。按“21”項方法進行測定，計算回收率，

12、結(jié)果平均回收率為 99.49 ，RSD為0.75(n=5)。見表l。表l  粉葛中葛根素的加樣回收試驗結(jié)果（略）2.10  樣品測定分別對6個不同產(chǎn)地的廣西粉葛樣品按“23”項下方法進行提取，按“21”項方法進行含量測定，結(jié)果見表2。表2  葛根素含量測定結(jié)果（略）3  討論3.1  流動相的選擇中國藥典2005年版部，關(guān)于粉葛藥材中葛根素的含量測定方法是以甲醇水(2575)為流動相，其葛根素的吸收峰與隨后的小峰的分離度為12左右，本實驗采用乙腈(A)0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脫可使葛根素與相鄰組分得到更好的分離，葛根素保留時間適中。流動相

13、中加入適量的磷酸溶液,可使色譜峰對稱,不拖尾。3.2  檢測波長的選擇取葛根素適量，加30 乙醇制成對照品溶液，置紫外分光光度計記錄其紫外吸收光譜，結(jié)果顯示，葛根素在250 nm波長處有最大吸收，故選擇250nm為測定波長。供試品與葛根素對照品在相應(yīng)位置上有相似的吸收峰且分離度良好。3.3  樣品提取條件的比較實驗比較甲醇和乙醇兩種提取溶劑，結(jié)果表明用30 乙醇做提取溶劑，提取較為完全且毒性較小。對超聲處理時間進行了考察，結(jié)果表明超聲處理時間60 min為佳。3.4  本法樣品處理方法便捷，測定方法簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，實踐結(jié)果表明，可用于廣西粉葛的制備、制劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。3.5  從樣品的HPLC圖譜顯示，本方法各組分分離效果良好，故本方法也可用于粉葛中其它成分的含量測定分析，此工作有待今后進一步開展。參考文獻：1  國家藥典委員會. 中國藥典,部S. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：203.2  江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（下冊）M.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985：2307.3  陳  斌，劉訓(xùn)紅，蔡寶昌.葛根高效液相色譜指紋圖譜的研究J.時珍國醫(yī)國藥， 2005，16（5）：384.4  陳連璧，柴  強，趙愛萍，等葛根素