實驗六果蠅唾液腺染色體的觀察及制備

1、實驗五 果蠅唾液腺染色體的觀察及制備 一.目的1.了解果蠅唾液腺染色體的形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)特征。2.習(xí)分離果蠅幼蟲唾液腺的技術(shù)。3.掌握唾液腺染色體制片方法。二、原理蠅、搖蚊幼蟲唾液腺細(xì)胞中的巨大染色體。雙翅目昆蟲 的唾液腺細(xì)胞發(fā)育到一定階段之后就不再進(jìn)行有絲分裂,而 永久停留在分裂間期。但隨著幼蟲的生長,唾液腺染色體仍 不斷地進(jìn)行自我復(fù)制而且不分開,經(jīng)過許多次的復(fù)制形成約 1 000 4 000拷貝的染色體絲,合起來直徑達(dá) 5m ,長度 達(dá) 400m ,比普通細(xì)胞中期染色體約大 100150倍,所以 又稱為多線染色體(polytene chromosome或巨大染色體 (giant chromo

2、some。唾液腺染色體的另一特點是體細(xì)胞中同源染色體處于 緊密配對狀態(tài),這種狀態(tài)稱為“體細(xì)胞聯(lián)會”。在以后不斷 的復(fù)制中仍不分開,由此成千上萬條核蛋白纖維絲唾液腺染 色體(salivary gland chromosome是一類存在于雙翅目 昆蟲,如果結(jié)合在一起,緊密盤繞。所以細(xì)胞中染色體只呈 單倍數(shù)。黑腹果蠅的染色體數(shù)目 2n=8其中第、第染色 體為中部著絲粒染色體,第染色體和第 IX 染色體為端著 絲粒染色體。唾液腺染色體形成時,染色體著絲粒和近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)聚于一起形成一個染色中心(chromo-center ,所以在光學(xué)顯微鏡下可見從染色中心 處伸出 6條配對的染色體臂,其中 5條

3、為長臂, l 條為緊靠 染色中心的很短的臂。唾液腺染色體經(jīng)染色后,呈現(xiàn)深淺不同,疏密各異的橫紋 (band 。這些橫紋的數(shù)目,位置,寬窄及排列順序都具有 物種的特異性。研究認(rèn)為這些橫紋與染色體的基因是有一定 關(guān)系的。通過一定的實驗方法使果蠅唾液腺染色體各臂分散 開, 并且使帶紋、 膨突等特征不受雜質(zhì)影響清晰地顯示出來, 是進(jìn)行果蠅遺傳學(xué)研究的很重要的一個環(huán)節(jié).果蠅唾液腺染 色體在不同種間的共同點是染色體的著絲點位于一個染色 區(qū)域,但不同的種類往往其染色體臂數(shù)目不同.每條染色體 臂上分布著染色深淺不同、粗細(xì)各異的磺紋 (band, 這些 橫紋的寬窄疏密程度以及排列順序和數(shù)目又都有種的特異 性和種

4、內(nèi)的差異. 由此, 果蠅唾液腺染色體近幾十年來, 已 廣泛用于種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)生和種間親緣關(guān)系的研究中, 因為種 間及種內(nèi)不同品系和近緣種中的遺傳差異經(jīng)常反映在唾液 腺染色體的不聯(lián)會、形成泡 (puff、縊虞 (constriction和 間帶區(qū)的伸縮性以及頂體 (telomere的形態(tài)等多方面的差 異,而特別重要的是研究它的基因序列的差異 (觀察是否產(chǎn) 生了例位以及染色體的斷裂、融合和重排 . 因此,無論從 細(xì)胞遺傳學(xué)的角度研究基因與突變性狀之間的聯(lián)系,還是從進(jìn)化遺傳遺傳學(xué)方面研究染色體的系統(tǒng)發(fā)生,探討種間以及 近緣種間的遺傳差異和生殖隔離的機(jī)制等,唾液腺染色體的 分析研究都是十分重要的.從其橫紋

5、分布特征可對物種的進(jìn) 化特征進(jìn)行比較分析,而一旦染色體上發(fā)生了缺失,重復(fù), 倒位。易位等結(jié)構(gòu)變化,也可較容易地在唾液腺染色體上觀 察識別出來。三、儀器設(shè)備及材料,試濟(jì)儀器設(shè)備:解剖鏡,顯微鏡,恒溫培養(yǎng)箱,鑷子,解剖針, 載玻片及蓋玻片,吸水紙解剖鏡,顯微鏡,恒溫培養(yǎng)箱,鑷子,解剖針,載玻片及蓋 玻片。材料 :黑腹果蠅(Drosophila melanogaster 三齡幼蟲 試劑:醋酸洋紅液,蒸溜水,濃鹽酸五、實驗步驟1.材料準(zhǔn)備 發(fā)育充足、肥大的三齡幼蟲,唾液腺和唾液腺 細(xì)胞發(fā)育良好。利用這樣的唾液腺細(xì)胞才能制備出理想的染 色玻片標(biāo)本。因此要求培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富,含水量較高。比較 松軟,發(fā)酵良好

6、。2.剝離唾腺 在一干凈載玻片上滴一滴生理鹽水,選擇行動 遲緩、肥大、爬在管壁上即將化蛹的三齡幼蟲,或者選擇經(jīng) 低溫處理的果蠅三齡幼蟲置于載玻片上。如果分不清頭尾著 可以從它爬行的時候確認(rèn)其頭尾,由于果蠅的唾液腺位于幼3. 低滲處理:將唾液腺放于低濃度的 Nacl 溶液中處理 10-15min, 以使細(xì)胞充分吸水而容易弄破。4. 解離 將唾液腺在載玻片上滴一滴 lmol /L HCI,讓唾液 腺在 lmol /L HCI中解離 2-3分鐘,以松軟組織,利于染 色體分散。5. 染色 解離后的腺體可用水沖洗 2-3次后滴 2滴品紅染 液染色 20分鐘 (解剖和染色過程勿使腺體于燥 。在酒精燈 上加

7、熱以增強(qiáng)染色效果。可以不經(jīng)解離一步而直接染色,也 可以在將幼蟲頭部與身體拉開后馬上加染液染色,然后慢慢 剖離腺體.7.觀察 將制好的片子先用低倍顯微鏡觀察。找到好的染色 體于視野中心,再用高倍鏡觀察之。如果制片理想,可做成 永久制片。8.攝影 仔細(xì)觀察的唾液腺染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)并攝像。 五.實驗結(jié)果在顯微鏡下我們看到的結(jié)果如下六思考與討論1. 何謂先染色體 多線染色體上用原位分子雜交法進(jìn)行基因定位， 并就其結(jié) 構(gòu)與功能之間的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究， 因此是細(xì)胞學(xué)和遺傳 學(xué)研究的有用材料。 核內(nèi) DNA 多次復(fù)制產(chǎn)生的子染色體平行排列, 且體 細(xì)胞內(nèi)同源染色體配對, 緊密結(jié)合在一起, 從而阻止了 染色體

8、纖維進(jìn)一步聚縮, 形成體積很大的由多條染色體 組成的結(jié)構(gòu)叫多線染色體。多線化的細(xì)胞處于永久間期, 體 積 也 相 應(yīng) 增 大, 它 存 在 于 雙 翅 目 昆 蟲 的 幼 蟲 組 織 內(nèi) , 如唾液腺、氣管等。 2.如何區(qū)別你看到的就是唾腺染色體？ 答： （1）由于在唾液腺細(xì)胞中 8 條染色體之間以著絲粒互相 連結(jié)在一起形成染色盤或異染中心和同源染色體之間的假 聯(lián)會，經(jīng)堿性染料染色后，可以觀察到一個染色較深的染色 盤和以染色盤為中心向外輻射出的 5 條染色體臂。 (2在這些染色體臂上可以看到染色深淺不同， 被稱做明 帶、暗帶的橫紋，這些橫紋的位置，寬窄、數(shù)目都具有 物種的特異性。不同物種，不同

9、染色體的不同部位形態(tài) 位置是固定的。 因此根據(jù)染色體各條臂帶紋特征和各條 臂端部帶紋特征能準(zhǔn)確識別各條染色體。 (3在染色體臂 上還可看到某些帶紋通過染色體的解旋、 膨大形成的疏 松區(qū)和巴爾比尼氏環(huán)，其富含轉(zhuǎn)錄出來的 RNA，因此 不著色（4）. 唾液腺細(xì)胞處于永久早期，染色體解旋 呈伸展?fàn)顟B(tài)在幼蟲發(fā)育過程中細(xì)胞核中的 DNA 多次 復(fù)制， 但細(xì)胞、 細(xì)胞核不分裂。 復(fù)制后的染色單體 DNA 不分開，從而形成了多線染色體（5）每一臂上所有的 每一臂上所有的 橫紋的大小和位置是恒定的，即具有種的特征。 橫紋的大小和位置是恒定的，即具有種的特征。 3.在昆蟲學(xué)中，二齡幼蟲，三齡幼蟲有何生物學(xué)意義？

10、答： 果蠅是完全變態(tài)發(fā)育的生物之一，二齡幼蟲，三齡幼蟲是其 變態(tài)發(fā)育的重要特點。從初生卵發(fā)育至新羽化的成蟲為一個 完整的發(fā)育周期，在 25，60相對濕度條件下，大約為 10 天。通過控制養(yǎng)殖的溫度，可以加速和減緩果蠅的發(fā)育。 果蠅個體很小，幼蟲在三齡時達(dá)到最大，約 2 毫米，成年果 蠅也僅為 23 毫米。新羽化的雌性成蟲大約 8 小時之后即 可進(jìn)行交配，交配之后大約 40 小時開始產(chǎn)卵，第 4-5 天出現(xiàn) 產(chǎn)卵高峰。性成熟雌性果蠅生殖能力很強(qiáng)，產(chǎn)卵初期每天可 達(dá) 5070 枚，累計產(chǎn)卵可達(dá)上千枚。 黑腹果蠅是最普遍應(yīng)用于遺傳學(xué)的果蠅，也是奠定經(jīng)典遺傳 學(xué)基礎(chǔ)的重要模式生物之一，對其染色體組成和表型、基因 編碼和定位的認(rèn)識，是其它生物無法比擬的?；谇逦倪z 傳背景和便捷的遺傳操作，果蠅在發(fā)育生物學(xué)、生物化學(xué)、 分子生物學(xué)等