結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E鈣粘素和連環(huán)素表達

1、結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E鈣粘素和連環(huán)素表達        【摘要】     目的 探討結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E鈣粘素（E-cad）和連環(huán)素（-cat）表達的臨床意義。方法 采用組織芯片技術(shù)，應(yīng)用免疫組化方法檢測81例結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中E-cad和-cat的表達。結(jié)果 原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中-cat的正常表達率分別為23.46%和4.94%，原發(fā)灶中顯著高于轉(zhuǎn)移灶(P<0.01)，尤其是高中分化病例，轉(zhuǎn)移灶中異位表達率顯著高于原

2、發(fā)灶 (45.68%比28.40%，P<0.01)，尤其是管狀腺癌；原發(fā)灶中-cat表達強度顯著高于轉(zhuǎn)移灶(P<0.01)。E-cad的表達強度在原發(fā)灶顯著高于轉(zhuǎn)移灶(P<0.01)，尤其是管狀腺癌和高中分化病例。結(jié)論 低表達E-cad和-cat及異位表達-cat的結(jié)腸癌細胞可能具有較強的轉(zhuǎn)移能力，更易于發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。     【關(guān)鍵詞】  結(jié)腸腫瘤E鈣粘素連環(huán)素組織芯片免疫組織化學(xué)     Expression of E-cadherin and -catenin in Primar

3、y Lesion with Colon Carcinoma and the Metastatic Lymphonodes     GU Yan-jun1, ZHANG Shi-wu2, SONG Li-xin1, et al.    (1.Department of Pathology, Medical College of Chinese Peoples Armed Police Forces, Tianjin 300162, China;    2.Tianjin Tumor Hospita

4、l, Tianjin 300060, China)    Abstract: PurposeTo explore the clinical significance of expression of E-cadherin and -catenin in both primary lesion with colon carcinoma and the metastatic lymphonodes. Methods Immunohistochemical staining of E-cadherin and -catenin with tissue microarra

5、ys was carried out in 81 cases with colorectal carcinoma, including primary lesion and the metastatic lymphonodes. Results Expression rate of -catenin in primary lesion and metastatic nodes was 23.46% and 4.94%, respectively. The rate in metastatic lesion was significantly lower than that in primary

6、 lesion (P<0.01), especially that in well and moderately differentiated carcinoma. The extopic expression rate in metastatic carcinoma was significantly higher than that in primary lesion(45.68% vs. 28.40%,P<0.01)，especially in tubiform adenocarcinoma. Expression of -catenin in metastatic carc

7、inomas was significantly lower than that in primary colon carcinomas (P<0.01). Expression of E-cadherin in metastatic carcinoma was significantly lower than that in primary colon carcinoma(P<0.01)，especially in tubiform adenocarcinoma and well and moderately differentiated carcinoma. Conclusio

8、ns Colon cancer cells with low expression of E-cadherin and -catenin, and extopic expression of -catenin are more invasive and likely to lymphonglaudula metastasis.    Key words: colon neoplasms; E-cadherin; -catenin; tissue microarray; immunohistochemistry    

9、0; 惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移與細胞間粘附力的降低有關(guān)，其中E鈣粘素(E-cadherin，E-cad)和連環(huán)素(-catenin，-cat) 傳導(dǎo)通路具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)兩者在結(jié)腸癌中常出現(xiàn)表達異常，但目前未見關(guān)于結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中兩者表達關(guān)系的報道。本文應(yīng)用組織芯片技術(shù)，免疫組化方法，檢測81例結(jié)腸癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E-cad和-cat表達，探討其表達在結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移中作用。    1   材料與方法    1.1   材   料  

10、  收集天津腫瘤醫(yī)院19872002年間存檔的常規(guī)石蠟包埋的具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織標(biāo)本共81例。其中男性41例，女性40例；管狀腺癌63例和黏液腺癌18例；高中分化40例，低分化4例；有隨訪資料者47例。年齡2677歲，中位年齡48歲。所有患者術(shù)前均未接受任何輔助治療。其中行單純手術(shù)治療者41例，行手術(shù)加化療者25例，行手術(shù)加放療者11例，行手術(shù)加化療、放療者4例。每例石蠟標(biāo)本4m厚連續(xù)切片，用HE染色。    1.2   方   法    將這81 例結(jié)腸癌原發(fā)灶及其有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

11、的組織蠟塊重新切片，進行復(fù)習(xí)并確診。為了實驗研究的方便和減小定位誤差，根據(jù)HE 切片，我們對石蠟標(biāo)本中有代表性的點進行標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記好的點將這81例結(jié)腸癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的石蠟標(biāo)本制作成2個組織芯片。為了防止在打點、切片、染色或免疫組化過程中出現(xiàn)漏點、滑片及掉片現(xiàn)象，每個樣本我們均上樣兩個點。    采用免疫組化SP法在組織芯片上進行E-cad和-cat染色。鼠抗人E-cad和-cat抗體和SP試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。    免疫組化采用專用微波爐進行抗原微波熱修復(fù)，嚴格按SP 法操作流程染色。全程實驗用已知的陽性切片作

12、為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。    1.3   結(jié)果判定    E-cad表達于細胞膜，其標(biāo)記陽性細胞表現(xiàn)為細胞膜呈棕黃色顆粒著色。    -cat的表達分別從細胞膜、細胞漿、細胞核三個方面判斷，只有胞膜棕黃色顆粒著色者為陽性細胞，而細胞質(zhì)或細胞核呈棕黃色顆粒著色者為異位表達細胞。    1.4   結(jié)果記錄    根據(jù)Ropponen 等1介紹的方法對E-cad和-cat表達強度進行半定量分

13、類，-cat的異位表達細胞視為陰性表達細胞。在目鏡中裝入100目測微網(wǎng)格（Olympus），400×鏡下，每個點陣計數(shù)1 000個腫瘤細胞，計算E-cad或-cat陽性細胞百分比。    各病例兩組表達強度的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細胞>90%者為正常表達(+)，10%90%者為表達減弱(+)，<10%或完全消失者為陰性表達(-)。    因為-cat存在異位表達，計數(shù)其發(fā)生異位表達的例數(shù)，計算異位表達率。    1.5   統(tǒng)計學(xué)處理   

14、 用SPSS10.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用四格表資料的2檢驗進行兩組間率的比較；采用兩樣本資料或配對資料秩和檢驗進行E-cad和-cat表達強度的比較。    2   結(jié)   果    2.1   E-cad和-cat在結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)    轉(zhuǎn)移灶中的表達    所選81例結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E-cad表達均表現(xiàn)為表達減弱或陰性表達，但其表達強度明顯不同，原發(fā)灶中顯著高于轉(zhuǎn)移灶(P<

15、0.01)，其中6例表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶中表達強度高于原發(fā)灶，見表1。    所選81例結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中均可見-cat正常表達病例，-cat可異位表達于細胞質(zhì)和細胞核，尤其是細胞核。原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中-cat的正常表達率則分別為23.46%(19/81)和4.94%(4/81)，原發(fā)灶顯著高于轉(zhuǎn)移灶(2=11.40，P<0.01)；異位表達率分別為28.40%(23/81)和45.68%(37/81)，轉(zhuǎn)移灶顯著高于原發(fā)灶 (25.19，P<0.01)；原發(fā)灶中-cat表達強度顯著高于轉(zhuǎn)移灶(P<0.01)，其中11例表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶的表

16、達強度高于原發(fā)灶，見表1。    2.2   E-cad和-cat在結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)    轉(zhuǎn)移灶中的表達與臨床病理特征關(guān)系    所選81例病例中管狀腺癌63例，黏液腺癌18例。原發(fā)灶中E-cad表達強度在管狀腺癌明顯高于黏液腺癌(2=4.21，P<0.01)，而轉(zhuǎn)移灶中E-cad表達與組織學(xué)類型無關(guān)。原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中-cat的表達強度、正常表達率及異位表達率在管狀腺癌和黏液腺癌中均差異無顯著性。進一步分析不同組織學(xué)類型結(jié)腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶間兩者的表達情況，結(jié)果顯

17、示：管狀腺癌E-cad的表達強度在原發(fā)灶顯著高于轉(zhuǎn)移灶（Z-3.97，P<0.01），黏液腺癌中表達強度無明顯不同；管狀腺癌-cat異位表達率在轉(zhuǎn)移灶顯著高于原發(fā)灶(2=34.16，P<0.01)，管狀腺癌和黏液腺癌中-cat的表達強度在原發(fā)灶均顯著高于轉(zhuǎn)移灶(Z值分別為-3.3和-2.28，P<0.05)，結(jié)果見表2和表3。    所選81例病例中高中分化者40例，低分化者41例。原發(fā)灶中E-cad的表達強度在高中分化病例顯著高于低分化病例(Z=-2.68，P<0.01)，轉(zhuǎn)移灶中其表達與腫瘤分化程度無關(guān)。原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中-cat

18、表達強度與腫瘤分化程度無關(guān)。進一步分析不同分化程度腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶間兩者的表達情況，結(jié)果顯示：高中分化病例原發(fā)灶中E-cad表達強度顯著高于轉(zhuǎn)移灶（Z-3.13，P<0.01），低分化病例中原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶間E-cad表達強度差異無顯著性；高中分化病例原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中-cat正常表達率分別為30%(12/40)和5.00%(2/40)，前者顯著高于后者(2=8.66，P<0.01)，低分化病例中差異無顯著性，高中分化病例和低分化病例中-cat的表達強度在原發(fā)灶均顯著高于轉(zhuǎn)移灶（Z值分別為-2.38和-3.70，P0.05），結(jié)果見表2和表3。    2

19、.3   E-cad和-cat在結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達與預(yù)后關(guān)系     所選81例病例中有完整隨訪資料者47例。47例中術(shù)后36個月內(nèi)死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者29例，死亡率61.70%，術(shù)后60個月內(nèi)死亡者35例，死亡率為74.47%。原發(fā)灶中E-cad表達減弱及陰性表達者3年生存率分別為50.00%(14/28)和21.05%(4/19)，前者顯著高于后者 (2=4.01，P<0.05)，手術(shù)加輔助治療者和單純手術(shù)者5年生存率分別為45.00%(9/20)和11.11%(3/27)，前者顯著高于后者(2=6.94，P&l

20、t;0.01)，而原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中-cat表達強度、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤分化程度及手術(shù)時年齡等不同因素的3年和5年生存率無顯著性差異。    3   討   論    E-cad是鈣黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亞型的一種，其主要作用是通過與細胞表達的連環(huán)素如-cat相互作用，介導(dǎo)細胞間的粘附，維持上皮細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整。以前研究表明正常結(jié)腸黏膜上皮E-cad和-cat均表達于胞膜，陽性細胞均>90%，為正常表達，而結(jié)腸癌組織卻常出現(xiàn)兩者的表達減弱或缺失, 并且E-cad表達與Dukes分期呈

21、負相關(guān)，-cat在蛋白水平可出現(xiàn)細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)異位表達，基因水平則可發(fā)生基因突變2，3，但尚未見關(guān)于結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中兩者表達關(guān)系的報道。    本研究通過對81例結(jié)腸癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E-cad和-cat表達情況的研究發(fā)現(xiàn)：E-cad全部表現(xiàn)為表達減弱或陰性表達，未見其正常表達者，與以前的研究結(jié)果相似，但值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶中E-cad的表達強度在管狀腺癌顯著高于黏液腺癌，并且管狀腺癌和高中分化病例原發(fā)灶中E-cad表達強度均顯著高于轉(zhuǎn)移灶，而黏液腺癌和低分化病例中差異無顯著性，表明發(fā)生轉(zhuǎn)移的管狀腺癌和高中分化癌細胞表達的E-cad

22、顯著減少，其表達下降或陰性表達可降低細胞間的粘附力，細胞易于彌散，而原發(fā)灶的黏液腺癌和低分化癌細胞則具有更強的轉(zhuǎn)移能力，提示E-cad表達異常與結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，尤其是管狀腺癌和高中分化病例。以前研究表明與正常結(jié)腸黏膜上皮相比結(jié)腸癌中-cat的表達明顯減弱，本研究-cat的正常表達率在原發(fā)灶僅為23.46%，但亦顯著高于轉(zhuǎn)移灶的4.94%，而異位表達率在原發(fā)灶中為28.40%，顯著低于轉(zhuǎn)移灶的45.68%，尤其是管狀腺癌。進一步分析-cat表達強度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)管狀腺癌、黏液腺癌、高中分化病例和低分化病例原發(fā)灶中其表達均顯著高于轉(zhuǎn)移灶，提示發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細胞表達-cat減少，并且這種改變

23、與組織學(xué)類型和腫瘤分化程度無關(guān)，-cat表達減弱是結(jié)腸癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的原因之一。-cat 作為一種細胞骨架蛋白，其作用與其細胞內(nèi)存在狀態(tài)有關(guān)。結(jié)合型通過與E-cad結(jié)合參與細胞間粘附作用，游離型（異位分布于細胞質(zhì)和細胞核）則作為Wnt信號通路中的重要組成成分參與信號傳導(dǎo)4，并且核異位表達的癌細胞增殖活性較高5。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的癌細胞-cat的異位尤其是核異位表達明顯增多，這些細胞是否同時具有較高的分裂增殖活性還有待于進一步研究證實。值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)E-cad和-cat的表達強度分別有6例和11例表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶高于原發(fā)灶，這除了可能與樣品的選取有關(guān)外，是否提示轉(zhuǎn)移的癌細胞生物學(xué)行為不同與原

24、發(fā)灶的癌細胞，出現(xiàn)了新的異質(zhì)性。    多種因素可影響結(jié)腸癌患者的預(yù)后，如Dukes分期6、黏附分子、APC基因異常7等。本研究結(jié)果表明手術(shù)加輔助治療者5年生存率顯著高于單純手術(shù)者，原發(fā)灶中E-cad表達減弱者3年生存率顯著高于陰性表達者，提示治療方法及E-cad表達減弱與患者預(yù)后有關(guān)，而其它因素如腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤分化程度及手術(shù)時年齡等的3年及5年生存率差異無顯著性，這可能與所選病例均已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期較單一有關(guān)，因為有研究證實在決定結(jié)腸癌預(yù)后的各種因素中，臨床病理分期最為重要6。    腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移能力與其多

25、種分子表達異常有關(guān)。對比研究轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞和原發(fā)灶的腫瘤細胞有助于闡明其確切機制。本研究結(jié)果提示低表達E-cad和-cat及出現(xiàn)-cat異位表達的癌細胞可能具有較強的轉(zhuǎn)移能力，更易于發(fā)生淋巴道或血道轉(zhuǎn)移。    【參考文獻】  1    Ropponen KM, Eskelinen MJ, Lipponen PK, et al. Reduced expression of alpha catenin is associated with poor prognosis in colorectal carcinomaJ. J Clin Pathol, 1999, 52（1）:10-16.    2    Iwamoto M, Ahnen DJ, Franklin WA, et al. Expression of beta-catenin and full-length APC protein in normal and neopl