離子交換層析(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗二離子交換層析純化兔血清 IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基 - 乙基 - 葡萄糖凝膠 A-50 ）為弱堿性陰離子交換劑。用 NaOH 將 Cl - 型轉(zhuǎn)變?yōu)?OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的 球蛋白屬于中性蛋白（等電點為 pH6.85 7.5 ），其余均屬酸性蛋白。 pH7.2 7.4 的環(huán)境中。酸性蛋白均被 DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有 球蛋白便可在洗脫液中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的 IgG 。 【試劑與器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol

2、/L HCl 和 NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 5.0.02 NaN 3 6.PEG 7. 無水乙醇 8. 紫外分光光度計 9.1cm×20cm 玻璃層析柱 10. 自動部分收集器 【操作步驟】 1 DEAE-Sephadex A-50 預(yù)處理 稱 DEAE-Sephadex A-50 （下稱 A-50 ） 5g ，懸于 500ml 蒸餾水內(nèi)， 1h 后傾去上層細粒。按每克 A-50 加 0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，將浸泡于 0.5mol/L NaOH 液中，攪勻，靜置 30min ，裝入布

3、氏漏斗（墊有 2 層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至 pH 呈中性；再以 0.5mol/L HCl 同上操作過程處理，最后以 0.5mol/L NaOH 再處理一次，處理完后，將 A-50 浸泡于 0.1mol/L pH7.4 PBS 中過夜。 2 裝柱 （ 1 ）將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。 （ 2 ）將 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至 1/4 高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的 A-50 。待 A-50 凝膠沉降 2 3cm 高時，開啟出水口螺旋夾，控制流速 1ml/min ，同時連續(xù)

4、倒入糊狀 A-50 凝膠至所需高度。 （ 3 ）關(guān)閉出水口，待 A-50 凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。 3 平衡 啟開出水口螺旋夾，控制流速 4 滴 /min ，使約 2 倍床體積的洗脫液流出。并以 pH 計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之 PH 值與離子強度，兩者達到一致時關(guān)閉出水口，停止平衡。 4 加樣及洗脫 啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關(guān)閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品（ 0.5ml 血清，體積應(yīng)小于床體積的 2% ，蛋白濃度以 100mg 為宜）。松

5、開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進入柱內(nèi)，至與柱面相切時，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁 2 3 次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速， 4 滴 /min. 5 收集 開始洗脫的同時就以試管進行收集；每管收集 4ml. 共收集 10 15 管。 6 測蛋白 以 751 型紫外分光光度計分別測定每管 A 260 ，按公式計算各管蛋白含量。并以 A 280 為縱坐標，繪制洗脫曲線。 7 合并、濃縮 將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以 PEG （ Mw6000 ）濃縮至所需體積，加入 0.02 NaN 3

6、防腐，于 4 保存?zhèn)溆?。長期保存時應(yīng)貯于 -40 冰箱。 8 A-50 凝膠的再生 在柱上先以 2mol/L NaCl 洗脫雜蛋白至流出液的 A 280 <0.02 ，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將 A-50 再處理一遍即達再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中 4 保存；近期不用時，以無水酒精洗 2 次，再置 50 溫箱烘干，裝瓶內(nèi)保存。 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤

7、堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂 。 離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點，當?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負電

8、荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將 吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。 離子交換劑預(yù)處理和裝柱對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對于陽離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑

9、。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交

10、換劑交換總量的1-5。 洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放于同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的

11、溶液就會自動來補充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算： CC2（C2C1）（1V）A2/A1 式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1A2時為線性梯度，當A1A2時為凹形梯度，A1A2時為凸形梯度。 洗脫時應(yīng)滿足以下要求：洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。 洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗?zāi)康牡牟煌?，可采用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，并目的物。 離子交換劑的與保存離子交換劑可在柱上。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LN