家蠶突變體之間的遺傳關(guān)系

1、簡單序列重復(fù)(ISSR)區(qū)域標(biāo)記分析家蠶突變體蠶品種之間的遺傳關(guān)系Dhanikachalam Velu, Kangayam M. Ponnuvel*, Murugiah Muthulakshmi, RandhirK.Sinha,SyedM.H.Qadri印度，生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,中央養(yǎng)蠶的種質(zhì)資源中心,Hosur - 635109,Tamil Nadu,2007年10月23日出版,修訂于2008年1月7日, 錄于2008年1月24日生命科學(xué)學(xué)院生物工程 12-1蘇進(jìn)、 包艷春譯 指導(dǎo)老師：高明波老師摘要： 簡單序列重復(fù)區(qū)域(ISSR)標(biāo)記被用來確定基因突變蠶品種（家蠶）之間的關(guān)系。這項(xiàng)研究用15個(gè)

2、ISSR引物并包括簡單序列重復(fù)(SSR)?？偣伯a(chǎn)生了20個(gè)突變體，有113項(xiàng)被標(biāo)記,其中73.45%是多態(tài)的。在選擇突變體遺傳材料時(shí),平均有(1.7080±0.4567)等位基因,有效等位基因(1.5194±0.3950)和遺傳多樣性(Ht)(0.2901±0.0415)。使用未加權(quán)的兩組產(chǎn)生的樹狀圖與算術(shù)平均法(UPGMA)和統(tǒng)計(jì)分析方法，使用Neis的遺傳距離形成的一個(gè)主要組,分為6組，并從中分離出20個(gè)蠶突變體。因此,用ISSR擴(kuò)增來確定突變蠶品種間的遺傳變異性是一種有價(jià)值的方法。蠶品種種質(zhì)資源中心的維護(hù)就是用的此種方法。關(guān)鍵詞: 遺傳多樣性; 家蠶; 突變

3、體；ISSR引言 家蠶是被馴化的昆蟲，用于生產(chǎn)絲綢，在印度，養(yǎng)蠶是一個(gè)基本的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，它不僅可以提供高質(zhì)量的生絲，還可以提高農(nóng)民的收入。在印度，中央養(yǎng)蠶的種質(zhì)資源中心有432個(gè)蠶品種,其中有20 339突變體是二化的突變體和73 種多化的突變體蠶品種。這些蠶突變體在產(chǎn)量和其他表型參數(shù)方面都表明其生物多樣性。不同的蠶品種一般表現(xiàn)型也不一樣，例如，卵的顏色、幼蟲的外形、繭的形狀和顏色等。然而,遺傳同一性突變體在不同品系之間的關(guān)系也有類似的特征。 所以，形態(tài)特征無法準(zhǔn)確確定品種的遺傳身份。它必須用品種的分子特征來分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性，而分子標(biāo)記在形態(tài)學(xué)和生化標(biāo)記上有許多的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@些標(biāo)記不受環(huán)

4、境的影響，它是穩(wěn)定的、獨(dú)立的(Bernatsky and Tanksley, 1989; Gepts, 1993) 。用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛開發(fā)和應(yīng)用，如簡單序列重復(fù)標(biāo)記(SSR)(Tautz, 1989),隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)(Williams et al., 1990), 簡單重復(fù)序列區(qū)間標(biāo)記（ISSR）(Zietkiewicz et al., 1994), 和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）(Vos et al., 1995).限制性片段長度多態(tài)性(Botstein et al., 1980)。這些標(biāo)記技術(shù)常被用來研究某些植物和動(dòng)物種群動(dòng)態(tài)的遺傳多樣性(

5、Zeitkiewicz et al., 1994; Tsumura et al., 1996; Dayanadhan et al., 1997; Gabierelsen and Brochman,1998;Wolfe et al., 1998; Knox and Palmer,1999).如RFLP分子標(biāo)記(Shi et al., 1995), RAPD (Yasukochi, 1998), AFLP (Tan et al., 2001) and SSR (Reddy et al., 1999a; Miao et al., 2005) 用RFLP和PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)來研究蠶品種的遺傳關(guān)系，并構(gòu)

6、建其分子連鎖圖譜(Xia et al.,1998; Reddy et al., 1999a, 1999b; Nagaraju et al., 2001; Lu et al., 2002; Li et al., 2005). 也取得了進(jìn)展，確定RAPD標(biāo)記分配nonsusceptability位點(diǎn)densonucleovirus(Abe et al., 2000; Li et al., 2001)和抗核型多角體病毒（NPV）位點(diǎn)(Yao et al., 2003)。同樣，AFLP(Lu et al., 2004）和ISSR(Chatterjee and Mohandas, 2003)標(biāo)記被用來確

7、定的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）如產(chǎn)量性狀和產(chǎn)繭量。簡單重復(fù)序列區(qū)域（ISSR）標(biāo)記系統(tǒng)已被廣泛用于植物和動(dòng)物的遺傳分析(Zeitkiewicz et al., 1994; Reddy et al., 1999b;Bornet et al., 2002; Vijayan, 2004)。家蠶遺傳變異分析采用ISSR標(biāo)記法，(Li et al., 2007)。此外,ISSR擴(kuò)增技術(shù)能夠區(qū)分個(gè)體之間的變異(Zietkiewicz et al .,1994)和評估種質(zhì)的遺傳多樣性(Wolfe et al., 1998)，ISSR分子標(biāo)記法是利用非編碼位點(diǎn)分散在整個(gè)基因組中，產(chǎn)生大數(shù)量的片段的原理，具有生產(chǎn)重

8、復(fù)性高，和低成本等特點(diǎn)。 突變體蠶品種作為學(xué)術(shù)研究的對象，表現(xiàn)型遺傳連鎖圖譜提供了超過230個(gè)基因位點(diǎn)，分布于28個(gè)連鎖群中（n = 28），且整合集中在分子標(biāo)記連鎖圖譜和昆蟲的表型遺傳連鎖圖譜中(Doira, 1992)。它的發(fā)展促進(jìn)了昆蟲和其他鱗翅目昆蟲生物現(xiàn)象的觀察、分析和研究。在這項(xiàng)研究中，為了保護(hù)這些變異的蠶品種，選定了20個(gè)家蠶突變體為遺傳材料，并對每個(gè)突變體進(jìn)行了ISSR分析。材料和方法蠶品種二十個(gè)蠶突變體，表現(xiàn)型的差異（表1）被作為核心研究對象，把它們飼養(yǎng)在規(guī)定的溫度和濕度環(huán)境下(Krishnaswamy et al., 1977).隨機(jī)選擇十個(gè)蠶蛾，把它們的翅膀減除

9、，放入氯氮苯酚溶液中，分離DNA和用異戊醇分析其構(gòu)成(Suzuki et al., 1972). 把DNA溶于TE緩沖液（Tris EDTA）（pH 8）中，稀釋和量化的濃度為10納克每升，微量標(biāo)準(zhǔn)為DNA（10毫微克/L）。 表一 突變蠶選擇研究列表 ISSR引物PCR擴(kuò)增DNA 英國哥倫比亞大學(xué)共有25個(gè)ISSR引物被用于這項(xiàng)研究,其中15個(gè)引物顯示很高比例的多態(tài)性。（表二）。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)儀在MJ研究PTC 200完成，使用20L反應(yīng)混合物含有30 ng的DNA，2L 10×PCR緩沖液（MBI fermentas），0.2 mmolL

10、的dNTP，2.5毫摩爾/ L的氯化鎂，0.15mol/L引物和1 U Taq DNA聚合酶，PCR操作進(jìn)程為94°C 2分鐘40個(gè)周期，94°C 30 秒，50°C 30秒， 72 2分鐘和最后在72°C延長10分鐘. PCR產(chǎn)物決定了在1.5%瓊脂糖凝膠的Tris-乙酸/ EDTA緩沖（ 1×TAE）和恒定電壓80 V 2 h電泳，用溴化乙錠染色（0.5gml）和攝影與凝膠成像系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次且有條帶，所有的三個(gè)凝膠一致，清晰帶用于分析。弱帶不分析。 ISSR數(shù)據(jù)評估與分析 可獲得的和可復(fù)

11、制的放大DNA片段始終被轉(zhuǎn)換成能簡要描述的二進(jìn)制計(jì)數(shù)法，存在(= 1)和缺失(= 0)。在帶型分析的基礎(chǔ)上使用參數(shù)對遺傳變異進(jìn)行了分析,如多態(tài)性比例(P)分析,遺傳多樣性(Ht)分析和遺傳距離分析(Nei,1978),使用的是POPGENE軟件(Yeh and Boyle, 1997)。 UPGMA樹和引導(dǎo)分析分別使用的是(Sneath and Sokal, 1973l)PHYLIP 3.5 c軟件生成的項(xiàng)目(Felsenstein,1993)1000。結(jié)果通過ISSR分析遺傳變異性通過ISSR引物帶生成的光譜帶顯示了20個(gè)突變體之間的多態(tài)性(圖1)。15個(gè)ISSR引物生成113條帶,其中83

12、條帶具有多態(tài)性占73.45%。條帶在250 - 3000個(gè)堿基范圍內(nèi)。產(chǎn)生的條帶數(shù)從3變化（UBC 861）到14（UBC 807）（表2）表二 ISSR引物及其多態(tài)性列表的種群的多樣性分析表明，觀察到的等位基因的平均數(shù)（Na）為（1.7080±0.4567），有效等位基因數(shù)（Ne）（1.5194±0.3950），遺傳多樣性（HT）（0.2901±0.0415）和Shannon信息指數(shù)（I）（0.4216±0.2868），蠶品種之間的遺傳相似性范圍從0.57520.9558。在家蠶品種 TMS 75和 TMS 61中觀察到的最高相似性為0.9558 ，而

13、在家蠶品種TMS 38 和TMS 14之間觀察到的最低相似性為0.5752（表3）。基于Nei's的遺傳距離的遺傳距離值如表3。蠶突變體之間的遺傳距離距離從0.0453到0.5530不等。蠶品種TMS 75和TMS 61顯示最低遺傳距離為0.0453,而最高遺傳距離為0.5530。圖1。在20突變體中找到的ISSR帶譜的 UBC 809（a）和UBC 841（b）是在TMS 38和TMS 14之間。用Nei's遺傳距離模型產(chǎn)生的所有的突變體矩陣UPGMA種群分析如圖2。由6組形成一個(gè)主要的種群。第1組由五個(gè)突變體形成兩個(gè)子組,第一子組由三個(gè)突變體即TMS 75和TMS61，其遺

14、傳距離為0.0453。TMS 35是孤立的子組。第二子群由遺傳距離為0.2501的TMS 34和TMS 65組成。第二組由四個(gè)突變體組成，即TMS 2和TMS 12和2個(gè)集群（ODT和TMS 14）突變體組成，其遺傳距離為0.2276。同樣，第三組中，TMS 82 、TMS 69的遺傳距離為0.2165，用的是兩個(gè)突變體TMS62、TMS64。第四組由TMS 33和TMS 67，遺傳距離為0.2056。第五組包括三個(gè)突變體，TMS 32 、TMS 31和一個(gè)孤立的集群TMS 66，遺傳距離為0.2847，而第六組由TMS 38和TMS 17組成，其遺傳距離是0.3329。表三 Nei'

15、s遺傳同一性（對角線上方）和遺傳距離（對角線下方）討論突變體蠶由自發(fā)突變和人工誘變進(jìn)化而來。其形態(tài)特征和突變性狀的分離被用來作為遺傳分析的基本工具(Doira, 1992; Banno et al., 1994)。蠶品種的培育起源于日本，并被用來研究遺傳多樣性和物種數(shù)量之間的關(guān)系。UPGMA集群結(jié)果與Nei's遺傳距離表明，20突變蠶品種形成于一個(gè)主要集群和六個(gè)子集群，表明所有的突變體有相同的起源，因?yàn)樗麄儗儆诙云贩N。同樣的Similarly Reddy et al. (1999b)從不同的起源分析13個(gè)變異體，并將他們分為滯育和非滯育組。 在選定的突變體家蠶遺傳品種中，15個(gè)IS

16、SR引物共擴(kuò)增出113條帶，占多態(tài)性帶73.45% 。Li 團(tuán)隊(duì)（2007）在中國蠶業(yè)研究所進(jìn)行了ISSR擴(kuò)增，分析了不同蠶品種之間的遺傳關(guān)系(SRI-CAAS)。他們確定了保種技術(shù)，其中分別聚集應(yīng)用在在二化性和多化性品種中。在這項(xiàng)研究中，所有的突變體起源于由溫帶二化性品種形成的種群。然而，突變的蠶品種之間的遺傳距離為0.04530.5530。TMS 75和TMS 61兩個(gè)變異蠶之間有較低的遺傳距離0.0453，TMS 14和TMS 38之間的遺傳距離最高為0.5530，其表明這些突變體具有獨(dú)特的特征基因。顯然，從一個(gè)人工繁殖后被馴化的蠶品種，因?yàn)樯掣綦x；沒有基因在突變體之間交換。在突變體的

17、蠶品種、種群的多樣性分析結(jié)果表明，觀察到的等位基因的平均數(shù)（NA）（1.7080±0.4567），有效等位基因數(shù)（Ne）（1.5194±0.3950）和Shannon信息指數(shù)（）（0.4216±0.2868）。這些結(jié)果體現(xiàn)在自交群體中，且在目前的突變體中有較高的遺傳變異現(xiàn)象。類似的調(diào)查結(jié)果在不同地域的蠶，也有報(bào)道anthereae roylei(Kar et al., 2005)。在封閉的飼養(yǎng)條件下，飼養(yǎng)家蠶蠶品種包括突變體，高度缺乏隨機(jī)交配。對此封閉個(gè)體之間的交流通常用于維護(hù)基因庫的延續(xù)，因?yàn)橛捎诮唬ネ送穷l繁發(fā)生的。這些研究結(jié)果有助于分析蠶品種雜合性保持

18、，其中的遺傳距離表明在每一個(gè)遺傳個(gè)體中沒有較大的生殖隔離?？傊@項(xiàng)研究揭示了突變體之間的親緣關(guān)系。一個(gè)主要的種群表明，它們都有屬于同一起源的類似的化性。雜合性是對柞桑蠶馴化不同（少數(shù)家蠶是野生）(Kar et al., 2005)。然而，突變體間的遺傳距離的變化。根據(jù)觀察到的遺傳距離與TMS38和 TMS 14（遠(yuǎn)親）比較TMS38和 TMS 14（遠(yuǎn)親）蠶和TMS75、 TMS 61可能是近親。ISSR分子標(biāo)記的使用顯示長度數(shù)314條，帶譜的范圍從250到3000 bp，73.45% 的多態(tài)性，這表明突變體中的雜合性的適用范圍。這也證實(shí)了平均有效等位基因數(shù)。研究等位基因遺傳多樣性。以上研究

19、表明，ISSR標(biāo)記可以有效地用于系統(tǒng)性分析進(jìn)化家蠶和雜合性的關(guān)系。參考文獻(xiàn)Abe, H., Sugasaki, T., and Kanehara, M. (2000). Identification and genetic mapping of RAPD markers linked to the densonucleosis refractoriness gene, nsd-2, in the silkworm, Bombyx mori. Genes Genet. Syst. 75: 9396.Banno, Y., Noda, K., Kawaguchi, Y., Koga, K., and

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