探究墨角藻調(diào)雌性SD大鼠和人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞內(nèi)分泌激素的作用機(jī)理

1、探究墨角藻對(duì)雌性SD大鼠和人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞內(nèi)分泌激素的影響摘要：流行病學(xué)研究報(bào)告表明：典型的亞洲膳食人群跟西方膳食人群相比有較低的激素依賴(lài)性癌癥發(fā)病率這些膳食上的差別使得亞洲人攝取了更多的大豆。然而我們實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明：海帶的抗雌激素作用可能同樣有利于減少癌癥的發(fā)病率。以下針對(duì)絕經(jīng)前女性做的海帶攝入量跟內(nèi)分泌調(diào)節(jié)之間的相關(guān)關(guān)系實(shí)驗(yàn)，我們研究了海帶（墨角藻）對(duì)雌性大鼠和人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞(hLGC)的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。海帶會(huì)影響大鼠的發(fā)情周期：175mg·kg-1wt·d-1(P=0.05)4.3±0.96d5.4±1.7d；350mg·

2、kg-1wt·d-1(P=0.002)5.9±1.9d,并且100%延長(zhǎng)了大鼠的發(fā)情周期(P=0.02)。按照175mg·kg-1wt·d-1的劑量喂養(yǎng)大鼠兩周，17-雌二醇水平從48.9±4.5下降到40.2±3.2ng/L(P=0.13).四周后，17-雌二醇水平下降到36.7±2.2ng/L(P=0.02)。卵巢黃素化顆粒細(xì)胞,23,50以及75µmol/L劑量分別使17-雌二醇水平從4732±591下降到3632±758,3313±373，3060±538ng/L。海

3、帶攝入量同樣能提升卵巢黃素化顆粒細(xì)胞培育孕激素的水平。海帶提取物的IC值分別為42.4,31.8和40.7時(shí)能抑制雌激素和雌激素受體和，孕激素和孕激素受體之間的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明海帶的內(nèi)分泌調(diào)劑作用根基量有關(guān)，并且表明膳食中含較多海帶是日本地區(qū)激素依賴(lài)性疾病發(fā)病率如此之少的原因。關(guān)鍵字：墨角藻；大鼠；海帶；乳腺癌；內(nèi)分泌美國(guó)的激素依賴(lài)性癌癥發(fā)病率逐年上漲，我們?cè)陬A(yù)防這些癌癥上取得的微不足道的成果都讓我們對(duì)日本的膳食越來(lái)越感興趣，因?yàn)槿毡臼鞘澜缟先橄侔⒆訉m癌、卵巢癌發(fā)病率最低的國(guó)家之一。研究調(diào)查結(jié)果顯示，日本女性跟一同參加測(cè)試的西方女性相比，有較長(zhǎng)的生理周期和較低的血清雌二醇水平，這些都可能是

4、她們面臨較低的激素依賴(lài)性癌癥威脅的原因。到目前為止，亞洲人群中部分天生偏向選擇富含大豆膳食有利于降低這些癌癥的發(fā)病率。然而，Teas等人之前的假設(shè)是另一個(gè)有利因素可能是他們較高的海帶攝入量。在人體實(shí)驗(yàn)中，我們研究了墨角藻攝入量顯著增加了生理周期的天數(shù)，減少了循環(huán)中的17-雌二醇水平，并且提升絕經(jīng)前有異常生理周期史的女性的血清孕酮水平?，F(xiàn)階段的研究中，我們深入研究了在大鼠和人體內(nèi)墨角藻調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素對(duì)性激素和循環(huán)系統(tǒng)的作用。之前有研究表明，生理周期長(zhǎng)度跟乳腺癌、子宮癌、卵巢癌之間有反相關(guān)關(guān)系。生理周期長(zhǎng)度，月經(jīng)初潮時(shí)的年齡以及孕激素都可以作為反映內(nèi)源性雌二醇和更年期年齡的指標(biāo)。生理周期較短的女性

5、跟生理周期較長(zhǎng)的女性相比嗎，在她們的整個(gè)生殖周期中會(huì)有較多的月經(jīng)次數(shù)。因此，那些女性就會(huì)在生殖周期中花費(fèi)更多的時(shí)間在產(chǎn)生卵泡和黃體階段，這個(gè)階段中雌激素和孕激素水平，子宮內(nèi)膜和乳腺細(xì)胞都是處在最高的增殖率。也曾有報(bào)道指出，乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、肥胖、酒精攝入量這些因素跟持續(xù)刺激雌激素以及性激素失衡之間都有正相關(guān)關(guān)系。那些實(shí)驗(yàn)研究表明，暴露的雌激素，雌激素和孕酮的的比例失衡可能是雌激素依賴(lài)型疾病最至關(guān)重要的影響因素。在預(yù)防一些雌激素依賴(lài)性疾病的治療過(guò)程，還有高危個(gè)體的防御措施中，現(xiàn)階段主要的策略就是阻止雌激素通過(guò)雌激素受體或者封鎖芳香化酶。進(jìn)一步的措施是，識(shí)別發(fā)揮化學(xué)保護(hù)作用抑制內(nèi)源性雌激素產(chǎn)

6、生的膳食成分，這也許可能降低乳腺癌、子宮癌、卵巢癌額發(fā)病率。利用大鼠和人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細(xì)胞檢測(cè)化學(xué)性?xún)?nèi)分泌干擾物用來(lái)降低癌癥威脅。以雌性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)研究?jī)?nèi)分泌調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌作為模板參考。因?yàn)槿撕痛笫蟮穆殉卜置诤蔂柮删哂邢嗨菩?，所以一般用大鼠模型測(cè)試化學(xué)性?xún)?nèi)分泌干擾物。大鼠的發(fā)情期和人的生理周期中，雌二醇水平在發(fā)情期前和產(chǎn)卵期時(shí)達(dá)到峰值，孕激素水平在發(fā)情期和產(chǎn)黃體期時(shí)達(dá)到峰值。人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細(xì)胞顯著的刺激了黃體的產(chǎn)生，因?yàn)樗鼈冎С旨皶r(shí)的在循環(huán)中動(dòng)態(tài)選擇雌二醇和孕激素，在生理周期中的黃體期模擬血清激素水平。卵巢黃素化顆粒細(xì)胞培養(yǎng)成功應(yīng)用到研究化學(xué)性?xún)?nèi)分泌

7、干擾物，比如說(shuō)二噁英對(duì)卵巢雌激素和孕激素合成的作用。我們本次實(shí)驗(yàn)的目的就是建立起我們之前研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?)檢測(cè)膳食中控制墨角藻的攝入量是否會(huì)擾亂SD大鼠正常的發(fā)情周期和性激素的分泌2)利用墨角藻的提取物培養(yǎng)人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細(xì)胞以研究顆粒細(xì)胞中的激素反映。為了進(jìn)一步深入研究墨角藻提取物對(duì)對(duì)雌激素和孕激素的反映，我們?cè)u(píng)價(jià)它的結(jié)合雌激素受體、，孕激素受體親和力，以及它在培養(yǎng)人體原發(fā)性卵巢黃素化顆粒細(xì)胞中潛在的阻止芳香化酶活力的作用。材料和方法大鼠及其發(fā)情周期的檢測(cè)24只重量200-250g的成年雌性SD大鼠，安置它們獨(dú)自在鐵絲籠中。它們被允許自由采用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的膳食和水。經(jīng)過(guò)2周簡(jiǎn)短的調(diào)整

8、期，老鼠經(jīng)過(guò)每天的陰道細(xì)胞學(xué)檢測(cè)以用分期標(biāo)準(zhǔn)確定正常的發(fā)情周期。老師在實(shí)驗(yàn)前必須確保至少有兩次連續(xù)的發(fā)情周期。一個(gè)正常的發(fā)情周期被確定為35天。一個(gè)完整的發(fā)情周期被認(rèn)為是第一次發(fā)情到第二次發(fā)情之間的間隔。在試驗(yàn)期間每周檢測(cè)一次老鼠的重量。墨角藻的來(lái)源和劑量來(lái)自緬因州海岸的海水蔬菜市場(chǎng)的墨角藻干燥后，研磨成粉末狀。海帶是去年夏天從緬因?yàn)?、新不倫瑞克、新斯科舍收割?lái)的。加工過(guò)程需要太陽(yáng)曬干除根部以外的整個(gè)植體。干燥的海帶之后經(jīng)軋機(jī)制成粉末。劑量水平的有效范圍是根據(jù)之前的人類(lèi)研究報(bào)告和傳統(tǒng)的亞洲人膳食決定的，考慮到老鼠實(shí)驗(yàn)需要更大的劑量以增加老鼠新陳代謝速率來(lái)和人體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)獲得了倫理批準(zhǔn)

9、并且所有的實(shí)驗(yàn)都符合美國(guó)伯克利動(dòng)物保健中心和行政委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)。海帶的實(shí)驗(yàn)劑量(實(shí)驗(yàn)1) 大鼠被隨機(jī)分為三組，每組八只：一支賦形劑，一次低劑量(175mg·kg-1wt·d-1)，一次高劑量(350mg·kg-1wt·d-1)。墨角藻測(cè)量后注射入大鼠每天膳食的2g蘋(píng)果中。使用蘋(píng)果作為媒介有兩個(gè)好處：(1)避免了因灌腸產(chǎn)生的緊張；(2)大鼠在攝入蘋(píng)果的同時(shí)攝入了墨角藻，容易檢測(cè)和確保墨角藻的攝入。制作陰道涂片并且每天記錄檢測(cè)發(fā)情周期的日志。四周后，所有大鼠恢復(fù)正常飲食。實(shí)驗(yàn)期間大鼠沒(méi)有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)2)在早晨發(fā)情(由陰道細(xì)胞學(xué)檢查得知)

10、的19只處于正常發(fā)情周期的大鼠的尾靜脈中抽取1 ml血液在血清激素實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察性激素是否隨著時(shí)間的遷移而發(fā)生改變。抽血之后立即注射175mg·kg-1wt·d-1墨角藻。兩到四周間，再次抽取早晨發(fā)情大鼠的血液。血液樣本在室溫下凝結(jié)成塊，2000×g.的速度下離心處理10min。血清抽濾后在-20冷凍保藏用作后續(xù)分析時(shí)使用。高劑量實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)3)為了研究海帶膳食在大鼠體內(nèi)是否能使雌二醇達(dá)到較高的水平，發(fā)揮抗雌激素或孕激素的作用，選中8只雌激素水平50µg/L的大鼠。在早晨發(fā)情期的基礎(chǔ)抽血后給大鼠注射350mg·kg-1wt·d-1(P=0.

11、002)5.9±1.9d。一周膳食后，在大鼠早晨發(fā)情時(shí)進(jìn)行另一次抽血。動(dòng)物性激素檢測(cè)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷系統(tǒng)，按照操作規(guī)范使用ELISA試劑盒(No.DSL-10-6800)分三次測(cè)量血清孕激素。根據(jù)上文所述方法，使用放射免疫抗體檢測(cè)重復(fù)檢測(cè)17-雌二醇。天然海藻提取物將干燥，粉末狀的墨角藻(50g)放入蒸餾水和乙醇以1:1的比列混合的溶液中，墨角藻完全沉浸在溶液中，在室溫下攪拌24h。提取物在4500×g的速度下離心處理10min，進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干燥，在50%的乙醇溶液中重新溶解干燥物。天然海帶提取物的分子量估計(jì)是300g/mol，這是一種制藥行業(yè)測(cè)定未知生

12、物活性的植物組成常用的方法。hlGC培養(yǎng)和劑量從8位在生育中心接受輔助生育治療的女性體內(nèi)獲得顆粒細(xì)胞。對(duì)每位患者的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，制片，培養(yǎng)。簡(jiǎn)而言之，顆粒細(xì)胞在含有0.1U/mL絨毛膜促性腺激素,抗生素，5%胎牛血清的基本培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。48h后，細(xì)胞在乙醇溶液或25,50,75mmol/L海藻提取物中連續(xù)處理9d。最后一天的樣本用來(lái)檢測(cè)17-雌二醇和孕激素。顆粒細(xì)胞激素的檢測(cè) 參照前文所述方法使用RIA商用檢測(cè)儀(診斷產(chǎn)品)雌二醇和孕激素。雌二醇和孕激素受體結(jié)合檢測(cè) 海藻提取物對(duì)ER，ER和PR-B的親和力由前文提及的輻射競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)決定的。簡(jiǎn)而言之，3種濃度的干燥海藻提取物稀釋液(0.5

13、,5,50µmol/L)重新溶解在二甲基亞砜，與ER，ER，0.5nmol/L雌二醇溶液中，25下攪拌2h。在加入1µmol/L己烯雌酚的情況下可能存在非特異性結(jié)合。為了檢測(cè)到PR-B結(jié)合，海藻提取物用PR-B和1.4nmol/L放射性標(biāo)記的孕激素在4下處理2。加入1µmol/L孕激素的情況下可能存在特異性結(jié)合。用氚水總成檢測(cè)芳香化酶活性通過(guò)上文提及的在3H2O摻入含氚的雄烯二酮來(lái)測(cè)定芳香化酶活性。在含有300 nmol/L的雄烯二酮(10%,90%)的500µL MEM中培育hlGC細(xì)胞，37下處理2h，觀(guān)察海藻提取物存在和不存在的兩種情況(10,50

14、,100µmol/L)。數(shù)據(jù)分析 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1中，3組不同方法之間的差別可以通過(guò)兩種方差分析估算。成對(duì)比較程序被用來(lái)估計(jì)膳食治療組和膳食控制組兩組之間的差別。對(duì)于所有其他的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，使用商用數(shù)據(jù)分析軟件分析組與組之間的差別，數(shù)據(jù)分析的結(jié)果P<0.05被認(rèn)為較好。對(duì)于放射性配體結(jié)合檢測(cè)來(lái)說(shuō)，IC50是用數(shù)據(jù)分析工具箱的非線(xiàn)性最小二乘法回歸分析確定的。結(jié)論動(dòng)物實(shí)驗(yàn)海帶的實(shí)驗(yàn)劑量(實(shí)驗(yàn)1)30天內(nèi)每天都估算24只成年雌性SD大鼠的發(fā)情周期。大鼠膳食中含有175，350mg·kg-1·d-1(P=0.004)的海藻提取物的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果表明，大鼠的發(fā)情周期隨海藻提取物劑

15、量的增大而增長(zhǎng)。在空白對(duì)照組中，大鼠發(fā)情周期為4.3±0.96，,175mg·kg-1·d-1(P=0.05)劑量組中大鼠發(fā)情周期為5.4±1.7，350mg·kg-1·d-1(P=0.002)，劑量組中大鼠發(fā)情周期為5.9±1.9。深入研究得出，海帶治療100%顯著增加了動(dòng)情周期的發(fā)情時(shí)間長(zhǎng)度(P=0.002)。具體地說(shuō)，動(dòng)情周期的平均值為空白對(duì)照組0.97±0.22，175mg·kg-1·d-1(P=0.05)劑量組的平均值為1.4±0.54，350mg·kg-1

16、3;d-1,劑量組(P=0.002)的平均值為2.1±0.88.海帶治療對(duì)發(fā)情前期和發(fā)情后期的天數(shù)沒(méi)有顯著影響。檢測(cè)到0,175，350mg·kg-1·d-1,劑量組的整個(gè)動(dòng)情周期的天數(shù)分別為28.6±3.1,30.5±3.6,31.9±3.6。根據(jù)實(shí)驗(yàn)1可知，出去實(shí)驗(yàn)剩余的之外，5只大鼠停止了正常的發(fā)情周期。1只大鼠在發(fā)情期，4只大鼠在動(dòng)情期。對(duì)雌二醇血清和孕激素水平的影響(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2)175mg·kg-1·d-1的劑量持續(xù)兩周，17-雌二醇水平的平均值從48.9±4.5降低到40.2±3.2

17、ng/L(P=0.13),四周后同樣的劑量水平只有36.7±2.2ng/L(P=0.02)比基本值降低了25%，表明隨著時(shí)間的推移劑量的作用越來(lái)越顯著。空白對(duì)照組和治療組的血清孕激素水平?jīng)]有明顯的差別。高劑量實(shí)驗(yàn)（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3） 海帶膳食治療（350mg·kg-1·d-1）一周后，在高血清17-雌二醇水平的8只大鼠中，血清17-雌二醇水平下降了38%(P=0.02)(數(shù)據(jù)1)。6只大鼠的血清17-雌二醇水平還原范圍為25-58%，其中有2只大鼠對(duì)海帶沒(méi)有反映。孕激素水平在高劑量的作用下沒(méi)有明顯變化。海帶對(duì)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞的17-雌二醇和孕激素水平的水平 在hlG

18、C細(xì)胞的培養(yǎng)中，50,75µmol/L劑量明顯減少了30-35%的17-雌二醇水平。海帶治療同時(shí)濕度提高了hlGC細(xì)胞中孕激素的水平，然而，只有50µmol/L的劑量能提升(P=0.03)。放射性配體檢測(cè)在放射配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)中，海藻提取物發(fā)揮了對(duì)雌二醇和ER，ER及ER-結(jié)合，孕激素和PR-B結(jié)合的阻礙作用。這些數(shù)據(jù)顯示，提取物競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合ER，ER和PR-B，其中對(duì)ER的親和力最高。hlGC加入海藻提取物后芳香化酶的活性沒(méi)有明顯變化(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。討論本文我們通過(guò)監(jiān)控大鼠的發(fā)情周期以及性激素水平還有hlGC細(xì)胞培養(yǎng)中雌二醇的產(chǎn)量，提出了額外能表明墨角藻具有抗雌激素的

19、生物學(xué)作用的證據(jù)。具體地說(shuō)，海帶膳食在劑量控制的情況下整體提高了37%大鼠的發(fā)情周期，350mg·kg-1·d-1劑量組明顯延長(zhǎng)了大鼠的動(dòng)情周期。海帶膳食控制同時(shí)在大鼠雌激素產(chǎn)量方面還發(fā)揮了顯而易見(jiàn)的作用，導(dǎo)致循環(huán)中17-雌二醇水下降了18-33%。這些數(shù)據(jù)一致表明，我們能夠觀(guān)察遵循海帶膳食治療的女性到生理周期的延長(zhǎng)，雌二醇水平的下降。深入討論，本實(shí)驗(yàn)所用的劑量都是生物相關(guān)劑量，和日本人群攝取范圍3-13g/d一致。先前的實(shí)驗(yàn)表明大豆和染料以黃酮對(duì)大鼠發(fā)情周期沒(méi)有顯著影響，只延長(zhǎng)了10%的生理周期。跟大豆相比，海帶在發(fā)揮延長(zhǎng)生理周期起更重要的作用。在hlGC生物測(cè)定試驗(yàn)中深

20、入研究了墨角藻的抗雌性激素生理活性，墨角藻提取物導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中17-雌二醇水平下降了23-35%。這表明提取物同時(shí)具有抗雌性激素產(chǎn)生，增加其生物分解速率的作用。競(jìng)爭(zhēng)性抑制，改變表達(dá)基因，翻譯后修飾P450細(xì)胞色素酶成類(lèi)固醇或者進(jìn)入17-雌二醇新陳代謝影響雌激素水平。然而，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)海帶提取物有對(duì)芳香化酶的活性有抑制作用，被認(rèn)為是一個(gè)植物成分發(fā)揮抑制酶活性作用的潛在分子靶點(diǎn)。更深一步研究海帶提取物抑制hlGC培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生雌激素的實(shí)驗(yàn)仍在繼續(xù)。另一個(gè)潛在的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制就是競(jìng)爭(zhēng)性抑制性激素受體。海帶提取物就像是一個(gè)雌二醇結(jié)合ER，ER的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)阻礙劑，對(duì)ER選擇性抑制力遠(yuǎn)大于ER。這些數(shù)據(jù)

21、表明墨角藻中的成分能夠通過(guò)降低雌二醇和ER，ER的親和力成為雌二醇抑制劑。這兩個(gè)受體在很多海藻組織中都能找到，在基因轉(zhuǎn)錄中可以作為配體激活受體的轉(zhuǎn)錄因。盡管抑制ER，ER的與雌性激素結(jié)合活性具有相似性，ER，ER和其他配體的特異性結(jié)合可以通過(guò)他們?cè)诎薪M織中不同的功能特性區(qū)別。在最近的研究報(bào)道中，沒(méi)有證據(jù)表明SD大鼠的海帶膳食治療對(duì)孕激素有影響，只有在加入海帶提取物的hlGC培養(yǎng)中孕酮有微量的增加。但是，前人有驗(yàn)證墨角藻可以改善女性黃體期缺乏孕酮表現(xiàn)出較高的雌二醇水平。這種差異原因可能是之前研究報(bào)道中反常的雌激素跟孕激素比值。這就證明雌二醇高度相關(guān)的勝利濃度是一個(gè)直接的阻礙3-類(lèi)固醇脫氫酶的原因，結(jié)果導(dǎo)致人的黃體細(xì)胞孕激素收到抑制。那些高度循環(huán)的雌二醇，墨角藻的抗雌激素不僅消除產(chǎn)生雌二醇，同時(shí)也會(huì)通過(guò)緩解雌二醇對(duì)3-類(lèi)固醇脫氫酶阻礙作用來(lái)增加孕激素構(gòu)成。然而，海帶膳食治療對(duì)循環(huán)的孕激素水平潛在的影響需要更大人群作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象