黃酮類化合物

1、. . . . 1緒論黃酮類化合物的生理作用一直受到人們的關(guān)注。早在20世紀(jì)30代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有維生素C樣的活性。Pratt研究認(rèn)為，黃酮類化合物具有一級(jí)抗氧化劑的作用。隨著全球人口老齡化的加劇，老年性疾病的防治和抗氧化、抗衰老研究已引起廣泛關(guān)注，評(píng)價(jià)和篩選富含黃酮類化合物的植物資源已成為農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。甘草是我國傳統(tǒng)常用中草藥之一，也是我國重要的植物資源。甘草黃酮類成分是甘草中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)心血管功能、增強(qiáng)免疫力等作用。因此，開展甘草的深加工，使甘草資源得以充分利用，增加資源的附加值，前景十分可觀。1.1甘草研究概況1.1.

2、1甘草簡介甘草(Glycyrrhizae radix,GR)又名甜草根、粉草、靈通、國老等，為豆科甘草屬多年生草本植物。甘草株高4080cm，根莖粗壯，具有地下匐枝，主根圓柱形，長達(dá)12m，外皮紅褐色至暗褐色，橫斷面莖部淡黃色或黃色，有甜味，莖直立，密被白色短毛與刺毛狀腺體，羽狀復(fù)葉，具小葉717片，卵形、圓形，長1 3cm，寬1 2.5cm，總狀花序腋生，花密集:花冠蝶形，淡藍(lán)紫或紫紅色，長1425mm。莢果條狀長圓形、鐮刀形或彎曲成環(huán)狀，褐色，外面密被刺狀腺體與短毛，種子為28粒，扁圓形或腎形，黑色，花期67月，果期79月。我國藥典記載藥用甘草為烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草的干燥根與根莖

3、。甘草歸心、肺、脾、胃經(jīng)1，從古至今，廣為藥用。1.1.2甘草的功效，藥理藥效作用人類應(yīng)用甘草有近2400年的歷史，我國醫(yī)籍文獻(xiàn)記載甘草最早見于神農(nóng)百草經(jīng)，列為上品，稱有強(qiáng)堅(jiān)筋骨、長肌肉、倍力氣和解毒之功，能治五臟腹寒、熱邪氣與金瘡腫，東漢醫(yī)圣仲景(公元2世紀(jì))在其傷寒論中使用處方74%有甘草。梁朝名醫(yī)弘景(公元5世紀(jì))編著的名醫(yī)別錄中稱其為“美草、蜜甘、國老”，并冠以“眾藥之王”的稱號(hào)。明朝時(shí)珍在其本草綱目中把甘草放于1074種中藥的第一味，收錄于12卷之首。清朝吳其俊在他的植物名實(shí)圖考中，對(duì)甘草亦有較詳細(xì)的考證。本草正中寫道“甘草得中和之性，有調(diào)補(bǔ)之功，故毒藥得之解其毒，剛藥得之和其性，表

4、藥得之助其外，下藥得之緩其速。隨氣藥入氣，隨血藥入血，無往不可，故稱“國老”4。種植甘草中的甘草酸與黃酮提取純化工藝研究甘草經(jīng)我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)長期臨床實(shí)踐驗(yàn)證，確認(rèn)其有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效，可用于治療脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸氣短、咳嗽多痰、腹腔和四肢疼痛、癰腫瘡毒等癥，并用之緩解其它藥的毒性。甘草還具有抗寒、耐熱、耐旱、抗鹽堿、喜光等優(yōu)良特性，適生性強(qiáng)、生命力旺盛，為干早地區(qū)的植物資源之一。50年代以后，各國學(xué)者對(duì)甘草進(jìn)行了較為深入的研究，隨著研究的深入和新技術(shù)的不斷應(yīng)用，人們對(duì)甘草的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用也愈來愈廣泛。甘草不僅廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)上，而且應(yīng)用于食品、衛(wèi)生、輕工方面

5、。還具有防沙固沙、改良土壤等作用，在環(huán)保方面，防止水土流失與改良生態(tài)環(huán)境4-7。1.2國外甘草有效成分研究進(jìn)展1.2.1甘草的化學(xué)成分近年來，國外學(xué)者對(duì)甘草的化學(xué)成分作了大量的研究。在甘草中己發(fā)現(xiàn)和確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物類型有三萜皂昔、黃酮、香豆素、甾醇、生物堿、揮發(fā)油、有機(jī)酸、搪類、氨基酸等，其中三萜皂苷類和黃酮類是其主要成分，詳見綜述8-10。黃酮類的代表化合物有甘草素(liquihtigenin，LG)、異甘草素(isoliquiritigenin,ILG)、甘草苷(liquiritin，LN)、異甘草苷(isoliquiritin，ILN);甘草酸(又名草甜素，glycyrrhizic

6、acid，GA)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GTA)則是萜類的代表化合物。它們的結(jié)構(gòu)見圖1.111。1.2.2甘草黃酮類化合物的種類黃酮類化合物(Flavonoids)，又名生物類黃酮化合物(Bioflavoinoids)，亦稱維生素P，是自然界中存在的酚類物質(zhì)，常與維生素C伴存，屬植物次級(jí)代產(chǎn)物。在1952年以前黃酮類化合物主要是指基本母核為2一苯基色原酮(見圖1.2)的一系列化合物?，F(xiàn)在黃酮類化合物泛指兩個(gè)苯環(huán)(A和B)通過中央三碳鏈連，即具有C6一C3一C6基本母核(見圖1.3)的天然產(chǎn)物，其中C3部分可能是脂鏈，可能與C6部分形成六元和五元氧雜環(huán)。根據(jù)中央三碳鏈

7、的氧化程度、B環(huán)(苯)連接位置(2一或3一位)以與三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀等特點(diǎn)，可將甘草中黃酮類化合分為黃酮類、異黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類、二氫黃酮類、二氫異黃酮、查爾酮類、二氫查爾酮類等。據(jù)現(xiàn)有資料報(bào)道:迄今為止，國外己從甘草中分離鑒定出300多個(gè)黃酮類化合物13。1.2.3甘草黃酮類化合物的藥理學(xué)研究大量研究顯示，黃酮類化物具有抗菌、抗病毒、抗發(fā)炎、抗過敏以與抗血管舒等作用;另外，它還能抑脂質(zhì)過氧化、血小板凝聚、毛細(xì)管滲透性以與脆性;黃酮類化合物的此類效果都與它的抗氧化性相關(guān)。甘草屬植物中的黃酮類成分具有抑菌14,15、抗真菌16、抗腫瘤、抗誘變、抗病毒等廣泛的藥理作用。(1)抗腫瘤作用

8、藥理學(xué)研究表明，甘草中異黃酮類物質(zhì)具有植物雌激素活性，可以抑制乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞的增殖27，而其他的黃酮類物質(zhì)如甘草黃酮?jiǎng)t不具有這類雌激素活性。甘草查爾酮也可抑制癌細(xì)胞的生長28。也有研究顯示，二甲苯并蒽（DMB）類甘草黃酮可以消除致癌物質(zhì)，從而達(dá)到預(yù)防癌癥的功效29。我國學(xué)者馬靖等17報(bào)道了甘草提取物通過P53非依賴途徑誘導(dǎo)胃癌MGC一803細(xì)胞凋亡;其作用機(jī)制是鈣池排空操縱的外鈣流在甘草誘導(dǎo)MGC一803細(xì)胞凋亡之中發(fā)揮了決定性的作用18。馬靖等19還報(bào)道甘草提取物除可誘導(dǎo)胃癌MGC一803細(xì)胞凋亡之外，還可選擇性誘導(dǎo)肝癌HepG2、肺癌NSCLC與宮頸癌Hela等幾種人腫瘤細(xì)胞凋亡

9、。(2)抗HIV病毒日本人奧田拓男教授與宮本寬治助教報(bào)道，甘草中有3種黃酮成分對(duì)艾滋病病毒的增殖抑制能力為甘草甜素的25倍?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草素與異甘草素的抗HIV病毒的能力更高，引起國外廣泛注意20。甘草吡喃香豆素等多種甘草黃酮類成分可抑制HIV誘導(dǎo)的巨細(xì)胞形成，且未見細(xì)胞毒性。甘草查爾酮A在濃度為20mg·L-1時(shí)，能抑制HIV誘導(dǎo)的巨細(xì)胞形成21。(3)抗病原微生物作用甘草黃酮類化合物中抗菌成分較多，作用較強(qiáng)。甘草根中最常見的單體成分甘草苷、甘草素、異甘草苷和異甘草素對(duì)新城艾滋病毒有抑制作用。另外，甘草黃酮還有抗心率失常作用;最近，我國學(xué)者胡小鷹等22研究結(jié)果表明，甘草總黃

10、酮具有抗心率失常作用。從以上資料可以看出，國外學(xué)者對(duì)甘草黃酮類組份藥理活性研究已取得很多有價(jià)值的成果，充分說明了甘草黃酮是一類值得深入研究的有效成分。相信，在不久的將來，甘草黃酮類成分一定會(huì)作為一類高效低毒的天然藥物得到廣泛應(yīng)用。(4)抗氧化作用甘草中黃酮類成分普遍具有抗氧化活性，可以作為自由基清除劑22。甘草黃酮類物質(zhì)可以防止低密度脂蛋白(LDL)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低病人血漿中的低密度脂蛋白被氧化的易感系數(shù)，提高血漿中低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝集、抗滯留的能力23，可以用來治療各種由于血脂高、脂質(zhì)氧化所引起的疾病。甘草查爾酮B，D強(qiáng)烈地抑制過氧化陰離子，并顯示了對(duì)DPPH自由基的清除活性

11、24。甘草黃酮類化合物中的查爾酮和二氫黃酮，均為含有酚羥基的化合物，其對(duì)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）的生成具有明顯抑制作用，對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基有明顯的清除作用。甘草總黃酮對(duì)Fenton反應(yīng)生成的羥自由基具有較強(qiáng)的直接清除作用，效果明顯優(yōu)于甘露醇，其清除羥自由基的IC50是甘露醇的1/255，其抑制羥自由基生成的IC50是甘露醇的1/13925(5)保肝作用甘草黃酮可緩解CCl4引起的小鼠血清中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)與乳酸脫氫酶(LDH)活性的增高。CCl4經(jīng)肝微粒體酶細(xì)胞色素P450激活后生成·CCl3，·CCl3可攻擊肝細(xì)胞膜上磷脂分子，引起脂質(zhì)過氧化或與

12、肝微粒體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，損傷肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性，從而使胞漿可溶性酶滲入血液中。甘草黃酮可能由于保護(hù)了CCl4所致的肝細(xì)胞損傷，減少了GPT與LDH滲入血液，從而降低CCl4中毒小鼠血清GPT與LDH活性。研究表明甘草黃酮可以明顯抑制小鼠肝臟MDA增高和還原性谷胱甘肽的耗竭，其作用呈一定的量效關(guān)系，電鏡檢驗(yàn)表明甘草黃酮可保護(hù)乙醇所致的肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷；并且能抑制肝組織脂質(zhì)過氧化、提高小鼠肝臟SOD活性，減少肝組織脂褐素形成42，這一作用與甘草黃酮清除由酒精激活產(chǎn)生的氧自由基有關(guān)。甘草黃酮是一類生物活性較強(qiáng)的成分，近年來的研究表明，它對(duì)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛的生成有明顯的抑制

13、作用，能有效地清除體產(chǎn)生的O、OH等自由基，從而阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的增殖。(6)對(duì)消化系統(tǒng)的作用甘草黃酮對(duì)多種潰瘍模型引起的藥物性潰瘍均有明顯抑制作用，已作為消化性潰瘍藥收入日本醫(yī)藥品集中，其抗?jié)冏饔玫母什蔹S酮單體是：甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素等。仁等從提取甘草膏剩下的藥渣中得到富黃酮組分，已被我國批準(zhǔn)用于治療潰瘍病的二類藥物；最近賈世山也證明甘草葉乙醇提取物的富黃酮組分具有顯著抑制胃酸分泌過多的作用43。(7)抗菌作用據(jù)研究報(bào)道，甘草黃酮化合物甘草查爾酮A、甘草查爾酮B、光甘草定、光甘草素等對(duì)革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制作用相當(dāng)于鏈霉素，對(duì)酵母菌和真菌抑制作用高于

14、鏈霉素，但對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌抑制作用遠(yuǎn)低于鏈霉素44。甘草查爾酮A體外對(duì)革蘭氏陽性球菌、桿菌和棒型菌有明顯的抑制作用，其最低抑菌濃度為0.3g/mL8g/mL45。(8)抗心律失常作用胡小鷹等46研究結(jié)果表明，50 mg/kg100 mg/kg甘草總黃酮可延長烏頭堿誘發(fā)的小鼠心律失常潛伏期，減少氯仿誘發(fā)的小鼠心室纖顫陽性律；25mg/kg50mg/kg甘草總黃酮可增加喹巴因誘發(fā)豚鼠出現(xiàn)室性早搏、室速、室顫和心搏停止所用劑量。由于甘草黃酮類對(duì)烏頭堿誘發(fā)的心律失常有明顯拮抗作用，提示有效成分可能為異甘草素。甘草黃酮能夠?qū)篂躅^堿、BaCl2、冠脈結(jié)扎、CaCl2Ach混合液、氯仿、喹巴因誘發(fā)大鼠

15、和小鼠的心律失常47，說明其抗心律失常作用機(jī)制是多方面的。(9)抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)作用前聯(lián)學(xué)者研究表明，甘草香豆素有較強(qiáng)的消炎和抗變態(tài)作用，比磺胺和抗生素的藥效好。日本學(xué)者Shibata等從甘草中分離得到有抗炎活性的黃酮類成分甘草素。另外，從甘草中分離到的甘草查爾酮A對(duì)十二氧十四烷酰大戟二萜醇醋酸質(zhì)(TPA)所致腫瘤和炎性水腫均有抑制作用48。甘草中的異甘草苷和甘草苷對(duì)透明質(zhì)酸酶的活性和由免疫刺激所誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞的組胺釋放都有抑制作用。甘草查爾酮A和甘草查爾酮B還可抑制人多形核嗜中性白細(xì)胞中白三烯的生物合成，并可抑制該細(xì)胞的脫顆49。Yokata等報(bào)道從光果甘草中分離到的光甘草定具有明顯的抗炎和

16、抑制黑色素生成作用50。(10)對(duì)酶的抑制作用研究表明，甘草黃酮類化合物對(duì)多種酶具有抑制作用。如異甘草素、光甘草定和甘草西定等黃酮類化合物對(duì)環(huán)磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)有較強(qiáng)的抑制作用。而黃酮類化合物異甘草苷、甘草苷、甘草素對(duì)醛糖還原酶(AR)有抑制作用51。另外Hatano報(bào)道了甘草查爾酮A、甘草查爾酮B和異甘草素等數(shù)種甘草黃酮類化合物對(duì)單胺氧化酶(MAO)有抑制作用。(11)其它藥理作用此外，甘草黃酮類物質(zhì)還有抗衰老的作用，其機(jī)制主要與其抗氧化作用有關(guān)，對(duì)DNA具有保護(hù)作用。另外還有報(bào)道甘草黃酮具有抗血小板作用，Tawanta等報(bào)道，異甘草素具有抗血小板聚集作用，它們的作用強(qiáng)度在體相當(dāng)于

17、阿司匹林52。Somjen等研究表明光甘草定和光甘草素具有雌激素樣作用53。1.2.4甘草黃酮市場應(yīng)用調(diào)查(1)在食品添加劑方面的應(yīng)用在我國食品添加劑產(chǎn)業(yè)的品種結(jié)構(gòu)中，抗氧化劑是最薄弱的一環(huán)。尤其是天然抗氧化劑。目前國外共有此類商品47種，甘草抗氧化物的抗氧化效果明顯優(yōu)于BHA和BHT等。到目前為止，甘草抗氧化劑只有一個(gè)品種，是類黃酮的混合物。我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB2760）規(guī)定：甘草抗氧化劑可用于油脂、油炸食品、腌制魚、肉制品、餅干、方便面、含油食品，最大使用量0.2g/kg。(2)在保健品方面的應(yīng)用2001年9月，衛(wèi)生部下達(dá)通知，禁止用野生甘草提取物作保健食品配料，這直接影響了甘

18、草黃酮保健食品的研發(fā)與生產(chǎn)。蒙貝爾技術(shù)現(xiàn)正生產(chǎn)不同劑型的甘草健喉靈、甘草黃酮茶、甘草黃酮礦泉水、甘草膳食纖維與異甘草素等多種甘草制品。(3)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用目前以甘草黃酮為主要原料的新藥產(chǎn)品尚未正式進(jìn)入市場，對(duì)甘草黃酮中某些單體的藥理作用與藥用價(jià)值也只是處于實(shí)驗(yàn)研究階段。目前國只有九惠制藥廠生產(chǎn)的安胃瘍膠囊取得了國家二類新藥批號(hào)，主要在、等幾個(gè)地區(qū)銷售，年銷售額為2000萬左右。(4)在化妝品方面的應(yīng)用市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)54，與1998年的情況相比，目前許多美白、祛斑產(chǎn)品中都添加了天然美白成分，其中使用最多的天然成分是胎盤提取液與甘草提取物或甘草黃酮，如妮維雅美白防護(hù)日霜中加有甘草精華；羽西天然潤白

19、膏配方中加有甘草精華、葡萄籽提取液、桑樹根與天然水藻；雅芳美白系列產(chǎn)品中也含有甘草黃酮、胎盤素；迪奧生產(chǎn)的美白護(hù)膚露中同時(shí)加入了維生素C，熊果苷和甘草酸鹽3種美白成分；奧利天然化妝品生產(chǎn)的瑞草植物潤白營養(yǎng)霜含有甘草提取物等。還有夏奈爾、悅兒U.V.White、CD美白專業(yè)護(hù)膚、嘉娜寶艾麗美白、高絲精純美白露、美爽爽皙嫩白保養(yǎng)、資生堂UV white、資生堂懷潔皙嫩白露、雅芳美白系列和羽西天然潤白霜等美白產(chǎn)品均使用了甘草黃酮或甘草提取物55。2000年2月羅氏公司曾對(duì)全球美白產(chǎn)品進(jìn)行了市場調(diào)查，在調(diào)查的91個(gè)產(chǎn)品中，歐洲占42%，亞洲占28%，南非占20%，拉丁美洲占10%。調(diào)查結(jié)果顯示：目前，

20、應(yīng)用比較普遍的美白活性成分是氫醌、維生素C與其衍生物、甘草黃酮和紫外線吸收劑等。在中國市場上極具潛力的美白劑包括煙酰胺、皮素拮抗劑和甘草提取物等。因此，甘草黃酮是目前在化妝品中使用較多的天然活性成分之一，有著廣闊的應(yīng)用前景。2003年我國化妝品銷售額已超過500億元人民幣，在今后5-10年，也將以每年9%的速度增長，據(jù)預(yù)測到2010年銷售額可望突破1000億元人民幣。甘草黃酮的美白祛斑效果顯著，相信在未來化妝市場應(yīng)該有較好的發(fā)展前景。1.3甘草有效成分提取純化技術(shù)現(xiàn)狀黃酮類化合物種類很多，多數(shù)以甙元的形式存在，少數(shù)以游離形式存在。一般情況下，游離的黃酮類化合物難溶于水，而黃酮甙易溶于熱水，兩者

21、都能溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。易溶 水的要由帶糖苷鍵的黃酮苷類與花色苷組成，而溶于乙醇的要在黃酮苷元類化合物。甘草中黃酮類物質(zhì)主要以甙類的形式存在，其中主要是糖甙形式。游離甙元含量較低，故甘草黃酮即可用熱水提取，亦可用醇提取。目前用于甘草黃酮的提取方法主要有溶劑浸提法、堿提酸析法、酶輔助提取法、超逺輔助法、微波提取法、超臨界流體萃取法等，以與多種方法的復(fù)合提取法。要介紹幾種方法：1.3.1傳統(tǒng)回流提取方法甘草黃酮回流提取是目前國外提取甘草中黃酮類物質(zhì)最為廣泛的方法，由于黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑中，所以很多黃酮類物質(zhì)提取劑研究多采用有機(jī)溶劑提取?？捎美浣ɑ蚣?/p>

22、熱抽提法提取，不同有機(jī)溶劑對(duì)不同植物黃酮類化合物的提取效果具有一定的差異，其中乙醇和甲醇是普遍采用的提取溶劑38l。由于乙醇相對(duì)廉價(jià)，同時(shí)其殘留對(duì)人機(jī)體相對(duì)安全，常用70%的乙醇提取天然黃酮產(chǎn)物。但用有機(jī)試劑提取存在著較大的安全隱患，操作時(shí)需謹(jǐn)慎。1.3.2超聲波提取技術(shù)超聲波提取技術(shù)(Ultrasound Extraction,UE)是近年來應(yīng)用到中草藥有效成分提取分離的一種最新較為成熟的手段，利用超聲波的振動(dòng)空化、機(jī)械粉碎、攪拌等作用，使植物組織在溶劑中瞬時(shí)產(chǎn)生的空化泡崩潰，而使組織中的細(xì)胞破裂，利于溶劑滲透到植物細(xì)胞部，使細(xì)胞中的成分進(jìn)入溶劑中，加速相互滲透、溶解，以增加中藥材中有效成分

23、化合物在溶劑中的溶解39，40，41。炳奇等43l利用超聲波法從甘草中提取黃酮，通過對(duì)超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度與固液比等因素的研究發(fā)現(xiàn)最佳提取條件為超聲功率I000W，超聲時(shí)間75min，提取溫度40，固液比1:8;最佳提取條件下黃酮含量為3.61%。1.3.3微波提取技術(shù)微波萃取技術(shù)又稱微波輔助提取(Miccrowave assisted Extraction,MAE)是指使用適合的溶劑在微波反應(yīng)器中從天然藥用植物、礦物、動(dòng)物組織中提取各種化學(xué)成分的技術(shù)和方法。微波是指頻率為300到300000MHz的電磁波，介于紅外線和無線電波之間。微波的量子能級(jí)屬于德華力(分子間作用力)的疇，與化合

24、物鍵能相差甚遠(yuǎn)。美國通過研究認(rèn)證微波萃取法不會(huì)破壞任何被測分析物的分子結(jié)構(gòu)。在微波萃取中，被處理的物質(zhì)通常是能夠不同程度吸收微波能量的介質(zhì)，整個(gè)加熱過程是利用離子傳導(dǎo)和偶極子轉(zhuǎn)動(dòng)的機(jī)理，具有反應(yīng)靈敏、升溫速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)。由于吸收微波能，物料部溫度突然升高，在天然物料中的維管束和腺胞系統(tǒng)升溫更快，保持此溫度直至其部壓力超過細(xì)胞壁膨脹的能力，細(xì)胞破裂。位于細(xì)胞的有效成分從細(xì)胞壁自由流出，傳遞到萃取溶劑里。另一方面，由于不同物質(zhì)的tan6值不同，對(duì)微波能的吸收程度也不同，微波可以對(duì)體系中不同組分進(jìn)行選擇性加熱，從而使被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離出來，進(jìn)入到萃取溶劑中。微波萃取技術(shù)的原理就是利用

25、不同組分吸收微波能力的差異，使基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使得被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離，進(jìn)入到介電常數(shù)較小、微波吸收能力相對(duì)較差的萃取劑中，并達(dá)到較高的產(chǎn)率。萍，艷等45利用微波從甘草中提取總黃酮，并測定其含量。測得甘草中總黃酮含量為1.721%，平均回收率為98.2%，其提取速度快，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。1.3.4超臨界萃取方法超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction,簡稱SCF)是用超臨界流體（簡稱SCF0作為萃取溶劑，利用其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)混合物進(jìn)行萃取分離的一種新型技術(shù)46。超臨界流體萃取分離過程的原理是利用超臨界流

26、體的溶解能力與其密度的關(guān)系，即利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行的。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小的成分依次萃取出來。當(dāng)然，對(duì)應(yīng)各壓力圍所得到的萃取物不可能是單一的，但可以控制條件得到最佳比例的混合成分，然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的，所以超臨界流體萃取過程是由萃取和分離組合而成的47，48。其優(yōu)點(diǎn)是：可以在接近室溫(35一40)與CO2氣體籠罩下進(jìn)行提取，有效地防止了熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散。由于全過程不用有機(jī)溶劑，因此萃取物絕無殘留溶媒，同時(shí)也防止

27、了提取過程對(duì)人體的毒害和對(duì)環(huán)境的污染，是100%的純天然;萃取和分離合二為一，當(dāng)飽含溶解物的CO2一SCF流經(jīng)分離器時(shí)，由于壓力下降使得CO2與萃取物迅速成為兩相(氣液分離)而立即分開，不僅萃取效率高而且能耗較少，節(jié)約成本:CO2是一種不活潑的氣體，萃取過程不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且屬于不燃性氣體，無味、無臭、無毒，故安全性好;CO2價(jià)格便宜，純度高，容易取得，且在生產(chǎn)過程中循環(huán)使用，從而降低成本;壓力和溫度都可以成為調(diào)節(jié)萃取過程的參數(shù)。通過改變溫度或壓力達(dá)到萃取目的。壓力固定，改變溫度可將物質(zhì)分離;反之溫度固定，降低壓力使萃取物分離，因此工藝簡單易掌握，而且萃取速度快。付玉杰，祖元?jiǎng)偟?9利用超臨界

28、CO2c02萃取法對(duì)甘草黃酮進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)提取率比常規(guī)溶劑法高2.2倍。為工業(yè)化SFE一CO2法生產(chǎn)粗甘草黃酮提供了有價(jià)值的工藝參數(shù)。研究表明，利用超臨界CO2方法，在萃取壓力30MPa、萃取溫度50、原料與夾帶劑(85%乙醇)比15g/mL、CO2流量為10k/h、分離壓力5.5MPa、分離溫度40的條件下，得到的甘草黃酮類物質(zhì)與其他方法相比較具有很明顯的優(yōu)勢。1.3.5酶提取技術(shù)由于黃酮類物質(zhì)被細(xì)胞壁包圍不易提取，并且常有果膠粘結(jié)，因此加入一定量的纖維素酶、果膠酶可以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使提取傳質(zhì)阻力減小，利于黃酮類物質(zhì)的釋放出51。高保英等52利用纖維素酶果膠酶處理甘草提取甘草黃酮，研究發(fā)現(xiàn)

29、復(fù)合酶法提取的最佳條件:以纖維素酶、果膠酶組成的復(fù)合酶，40，pH5.0的條件下酶解3h，提取率可達(dá)1.66%，與微波法提取率相當(dāng)。酶法提取與微波法提取相比，提取成本低，耗能低，為提取甘草黃酮提供了一種新方法。1.4響應(yīng)面法簡介響應(yīng)面分析法(Response SurfaceMethodology,RSM)是由Box于1957提出的一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法11,目前已在黃酮、半纖維素、多糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸、生物堿等的提取工藝優(yōu)化上得到廣泛應(yīng)用12-16。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法對(duì)甘草酸和黃酮聯(lián)合提取的主要工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了甘草酸和黃酮的同步提取,克服了分步

30、提取甘草酸和黃酮工藝的缺點(diǎn),可為甘草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持。響應(yīng)面是指響應(yīng)Y同一組輸入X1，X2,Xn之存在函數(shù)關(guān)系式Y(jié)=F(X1，X2,Xn)，則由Y=F(X1，X2,Xn)所表示的曲面叫做響應(yīng)面。在應(yīng)用響應(yīng)面法時(shí)，我們假定：(1)這個(gè)存在且輸入變量是連結(jié)的；(2)函數(shù)F在較窄的圍可以用一個(gè)低階的多項(xiàng)式逼近；(3)輸入量X1，X2,Xn在試驗(yàn)過程中可以控制和度量。響應(yīng)Y代表三維空間中的一曲面，為有得于目測響應(yīng)面的開頭，常畫出響應(yīng)面的等高線。在等高線圖中，每一條等高線對(duì)應(yīng)于響應(yīng)面的一個(gè)特定的高度，它有助于研究導(dǎo)致響應(yīng)面的形狀或高度改變時(shí)，輸入量X1，X2,Xn的水平。1.5甘草與其有效成

31、分的研究趨勢甘草是一味常用的中藥。隨著其化學(xué)成分研究的深入，發(fā)現(xiàn)了許多具有藥用值的生物活性化合物。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，甘草的研究也從宏觀走向微觀。既涉與復(fù)方應(yīng)用，又涉與基因分析。有關(guān)甘草與其復(fù)方藥物的藥理作用研究已開展較為廣泛，但甘草化學(xué)成分的微量鑒定與其臨床作用機(jī)理和效果評(píng)價(jià)有待進(jìn)一步研究。隨著先進(jìn)的分離技術(shù)不斷應(yīng)用到研究中來，相信還會(huì)有更新穎、藥用價(jià)值更高的先導(dǎo)化合物被陸續(xù)分離鑒定出來。將來的發(fā)展趨勢與研究工作的重點(diǎn)在于:(l)開發(fā)甘草的復(fù)方藥配制，并對(duì)其功效進(jìn)行研究，繼續(xù)分離研究甘草的有效物質(zhì)成分，并且研究有效成分的綜合藥理價(jià)值，在臨床上試驗(yàn)，然后產(chǎn)業(yè)化這些配方和有效成分，擴(kuò)大甘草的資

32、源利用價(jià)值。(2)合理開發(fā)已有甘草資源，甘草中的有效物質(zhì)眾多，那么合理利用這些有效物質(zhì)稱為當(dāng)前的研究重點(diǎn)，甘草的研究重點(diǎn)應(yīng)該放在人工種植甘草的上面，對(duì)野生甘草資源加以保護(hù)利用，建立循環(huán)利用的合理甘草資源市場。(3)提高甘草資源的深加工項(xiàng)目，消除甘草的初加工的浪費(fèi)，例如主根部分可以供給切片市場，側(cè)根部分可以進(jìn)行甘草有效物質(zhì)的深加工產(chǎn)品，向甘草有效成分提取的深加工發(fā)展。(4)生產(chǎn)工藝的開發(fā)，甘草中的有效物質(zhì)的多樣性，要求我們天然產(chǎn)物研究人員制定合理生產(chǎn)工藝，對(duì)甘草資源合理利用加上重點(diǎn)，改良舊的生產(chǎn)工藝，設(shè)計(jì)新的提取工藝，以降低生產(chǎn)成本，提高提取率，提高甘草中有效物質(zhì)的純度，增加產(chǎn)品的附加值。1.6

33、本課題研究的目的、意義和主要容1.6.1本課題研究的目的和意義近年來隨著甘草黃酮類物質(zhì)藥理作用研究的深入，尤其是具有較強(qiáng)的抗愛滋病活性，使甘草黃酮提取工藝研究越發(fā)重要。國有些生產(chǎn)廠家所用工藝落后，也不同程度地造成資源的浪費(fèi)。對(duì)甘草的深度開發(fā)和綜合利用是一項(xiàng)值得重視的課題。甘草的植物化學(xué)成雜，其主要的有效成分是三萜類和黃酮類化合物，而以往人們只對(duì)甘草中化合物作了大量深入的研究，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)也僅以甘草酸的含量作為質(zhì)量準(zhǔn)，顯然難以全面地評(píng)價(jià)甘草的質(zhì)量。近年來，隨著對(duì)甘草藥理作用的深表明甘草黃酮類化合物具有多種藥理作用43，是一類非常有效的活性成分目前中藥甘草研究的熱點(diǎn)。臨床與藥理研究表明，甘草黃酮類

34、成分中的甘和光甘草定具有抗氧化23,68-71、抗腫瘤72-75、抗菌44,76、免疫促進(jìn)和雌激性27,77,78等多種活性，在食品、醫(yī)藥和化妝品工業(yè)中有廣泛的用途。因此草中總黃酮與重要黃酮單體的的分離和藥效研究，建立甘草總黃酮與重要的含量測定方法，制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，開發(fā)其潛在的藥用價(jià)值，對(duì)有利用甘草資源具有十分重要的意義。由于人們對(duì)甘草無保護(hù)地洗劫性采挖，使野生甘草資源瀕臨枯竭，更重要的是使生態(tài)環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致草原沙化、氣候惡化、水土流失嚴(yán)重。國家為保護(hù)種植甘草中的黃酮提取純化工藝研究生態(tài)環(huán)境，立法并采取一系列措施，保護(hù)草原、山林與瀕危物種，野生甘草被列入保護(hù)物種，禁挖、禁運(yùn)。為解決甘

35、草供需矛盾，國家出臺(tái)政策在對(duì)野生甘草禁止采挖的同時(shí)大力推廣和研究甘草的種植技術(shù)，但是家種甘草產(chǎn)品能否替代野生甘草，黃酮含量是否達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，還是當(dāng)今關(guān)注的熱點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)甘草資源高附加值產(chǎn)品的加工生產(chǎn)奠定了產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)。應(yīng)用該工藝，將對(duì)種植甘草的后續(xù)開發(fā)具有重要的研究價(jià)值。1.6.2本課題研究的主要容本題目主要是對(duì)影響甘草中黃酮成分提取率的各個(gè)因素進(jìn)行研究，篩選黃酮提取生產(chǎn)的最佳工藝條件。甄選提取方法，提取溶劑，并對(duì)提取過程中的溫度、時(shí)間、提取次數(shù)等各個(gè)因素與提取效果的影響進(jìn)行全面的考察，采用響應(yīng)面分析法篩選優(yōu)化的提取黃酮的生產(chǎn)工藝條件與參數(shù)。2甘草中黃酮成分的提取研究甘草的植物化學(xué)成分十分復(fù)雜，其

36、藥用有效成分為甘草酸和黃酮類化合物以與水溶性浸出物、還原糖、淀粉、氨基酸、有機(jī)酸、生物堿和多種金屬元素等。近年來，隨著人們對(duì)甘草藥理作用的深入研究，結(jié)果表明甘草黃酮類物質(zhì)是非常有效的活性成分，己成為研究的熱點(diǎn)。而隨著甘草資源的過度開發(fā)，甘草資源已受到前所未有的破壞。如何有效地利用有限的甘草資源成了巫待解決的問題。本章采用分光光度計(jì)測定了甘草中總黃酮的含量，為合理開發(fā)利用甘草資源提供依據(jù)。2.1材料和方法2.1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑甘草：市仲景大藥房亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，95%乙醇、甲醇、無水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯等2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備721GW可見光分光光度計(jì) 精密科學(xué)食

37、品離心機(jī) 中興偉業(yè)儀器pH計(jì) 精密科學(xué)儀器酒精計(jì) 精密科學(xué)儀器電子天平 賽多利斯天平恒溫振蕩器 杜甫儀器廠蘆丁 試劑廠2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1工藝流程黃酮成分粗提時(shí)的大致工藝流程如下：甘草粉碎浸提抽濾合并濾液減壓蒸餾真空干燥黃酮類化合物2.2.2黃酮類化合物的測定原理黃酮類特是廣泛存在于植物中的一類黃色素，在氧化劑亞硝酸鹽存在的情況下，與硝酸鋁生成黃色的黃酮鋁絡(luò)合物，在堿性環(huán)境下顯紅色，采用絡(luò)合分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品測定甘草中總黃酮的量，加入鋁離子試劑使黃酮類化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物在可見光獲得穩(wěn)定的吸收峰。因此采用NaNO2Al(NO3)3顯色法，利用紫外可見分光光度計(jì)在較大穩(wěn)定吸收波長5

38、07nm處測定吸光度值，對(duì)照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得總黃酮的含量，計(jì)算出黃酮提取率。2.2.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)備稱取經(jīng)105烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15mg，用80%乙醇溶解定容在100mL容量瓶，得到0.15mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，精密吸取0.0mL, 1.0mL, 2.0mL, 3.0mL, 4.0mL, 5.0mL, 6.0mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于七個(gè)潔凈的25mL容量瓶中，分別向這七個(gè)盛蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的容量并中加入6.0mL, 5.0mL, 4.0mL, 3.0mL, 2.0mL, 1.0mL, 0.0mL的80%乙醇溶液，然后向每個(gè)容量瓶中各加入5%NaNO2溶液1.0mL充分振蕩后靜默6min，

39、再向每個(gè)容量瓶中加入10%Al(NO3)3溶液1.0mL,充分振蕩后靜置6min，向每個(gè)容量瓶中加入10%NaOH溶液10.0mL,然后用80%乙醇定容至25mL容量瓶刻度處，充分振蕩后靜置15min,在507nm處測吸光度。242.2.4甘草中黃酮提取率計(jì)算提取率=提取物的重量（mg）/甘草的重量（g）2.2.5單因素試驗(yàn)(1)不同溶劑對(duì)提取率的影響分別準(zhǔn)確稱取2.0g甘草粉，在固液比1：25(g/mL),50的水浴，振蕩速度140r/min條件下提取2h，分別的提取溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯。(2)不同溫度對(duì)提取率的影響分別準(zhǔn)確稱取2.0g甘草粉，75%乙醇作為提取溶劑，固

40、液比1：25(g/mL), 振蕩速度140r/min，在不同溫度下提取2h，提取溫度分別為：30、40、50、60、70、80、90。(3)不同時(shí)間對(duì)提取率的影響分別準(zhǔn)確稱取2.0g甘草粉，75%乙醇作為提取溶劑，固液比1：25(g/mL),提取溫度50， 振蕩速度140r/min條件下，提取時(shí)間分別為：0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h。(4)不同濃度對(duì)提取率的影響分別準(zhǔn)確稱取2.0g甘草粉，乙醇作為提取溶劑，固液比1：25(g/mL), 提取溫度50， 振蕩速度140r/min條件下提取2h，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、1

41、00%。(5)不同液固比對(duì)提取率的影響分別準(zhǔn)確稱取2.0g甘草粉，75%乙醇作為提取溶劑，提取溫度50， 振蕩速度140r/min條件下提取2h，液固比分別為：10：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1。(6)不同提取次數(shù)對(duì)提取率的影響分別準(zhǔn)確稱取2.0g甘草粉，75%乙醇作為提取溶劑，固液比1：25(g/mL),提取溫度50，蕩速度140r/min條件下提取2h，提取次數(shù)分別為：1次、2次、3次。2.2.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件采用PlackettBurman設(shè)計(jì)、中心組合設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析法。本研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析與模型建立皆采用SAS軟件(Version9.0

42、)來進(jìn)行。根據(jù)前邊單因素試驗(yàn)，確定提取溶劑為乙醇。以不同的提取溫度、提取時(shí)間、提取溶劑濃度、液固比做響應(yīng)面分析試驗(yàn)。因素水平如表：表21部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子與編碼值Table 21 Analyzes the factor of design and coding value水平液固比X1(mL:g)乙醇濃度X2(%)提取時(shí)間X3(h)提取溫度X4()提取次數(shù)X5（次）-125:1601.5501030:1702602135:1802.57032.2.7驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定提取溫度、提取時(shí)間、提取溶劑濃度、液固比、提取次數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。2.3結(jié)果與分析2.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與結(jié)

43、果將濃度為0.15mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在507nm處測吸光度值，如表22所示：表22蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在507nm處的吸光度值Table 22 Rutin standard solution absorbance at 507nm Department蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液體積(mL)蘆丁含量(mg)吸光度值0.00.000.0001.00.150.0652.00.300.1163.00.450.1564.00.600.2125.00.750.2656.00.900.310根據(jù)數(shù)據(jù)得到蘆丁含量和吸光度值之間的一元線性回歸議程為：y=0.3395x+0.0078其中y：507nm處的吸光度值；x：黃酮的含量(mg

44、)；經(jīng)過計(jì)算，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9975，回歸極顯著。所以在濃度為00.9mg/mL的圍，是可以用該方法檢測蘆丁含量的。圖22蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 22 Rutin criterion liquid2.3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果(1)提取溶劑的選擇圖23不同提取溶劑對(duì)應(yīng)的黃酮提取率Fig. 23 Corresponding to different solvent extraction yield由圖23可以看出以甲醇和乙醇為提取溶劑所得到的提取率較高，且甲醇作為提取溶劑時(shí)提取率比乙醇稍高，但考慮到溶劑的成本價(jià)格與對(duì)環(huán)保問題的綜合影響因素，決定選取乙醇作為以下試驗(yàn)的提取溶劑。(2)提取溫度的選擇溫度()圖24不同提取溫度對(duì)應(yīng)的黃酮提取率Fig. 24 Temperature corresponding to different extra