選修3-1-1DNA重組技術的基本工具

1、 基因工程 第一節(jié)： DNA重組技術的基本工具 ?？h一中?？h一中 劉秀榮劉秀榮據據WTOWTO調查：調查：20042004年全世界因狂犬病致死人數約年全世界因狂犬病致死人數約5.55.5萬人萬人中國衛(wèi)生部通報：中國衛(wèi)生部通報：20042004年月，狂犬病列法定報告年月，狂犬病列法定報告?zhèn)魅静∷劳鰯抵?。傳染病死亡數之首。發(fā)病死亡率近發(fā)病死亡率近100%100% . .能產生狂犬病抗體蛋白能產生狂犬病抗體蛋白的轉基因植物的轉基因植物基因工程的概念基因工程的概念指按照人們的愿望，進行指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過嚴格的設計，并通過體外體外DNA重組重組轉基轉基因因DNA分子水分子水平平基

2、因工程的別名基因工程的別名DNA重組技術重組技術操作環(huán)境操作環(huán)境生物體外生物體外操作對象操作對象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本過程基本過程剪切剪切拼接拼接導入導入表達表達結果結果人類需要的基因產物或性狀人類需要的基因產物或性狀概念分析：問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。想一想想一想需要做哪些關鍵工作？需要做哪些關鍵工作？蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌普通棉花抗蟲棉普通棉花抗蟲棉普通棉

3、花普通棉花( (無抗蟲特性無抗蟲特性) )蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌提取提取抗蟲基因抗蟲基因棉花細胞棉花細胞( (含抗蟲基因含抗蟲基因) )棉花植株棉花植株( (有抗蟲特性有抗蟲特性) )上述培育抗蟲棉的關鍵步驟是什么？上述培育抗蟲棉的關鍵步驟是什么？重組重組DNADNA導入導入形成形成基因工程培育抗蟲棉的簡要過程基因工程培育抗蟲棉的簡要過程基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟關鍵步驟一：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來細胞內提取出來關鍵步驟二：關鍵步驟二：形成重組形成重組DNADNA關鍵步驟三：關鍵步驟三：重組重組DNADNA導

4、入受體導入受體( (棉花棉花) )細胞細胞1.1 DNA重組技術的基本工具重組技術的基本工具關鍵步驟一：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來細胞內提取出來關鍵步驟二：關鍵步驟二：形成重組形成重組DNADNA關鍵步驟三：關鍵步驟三：重組重組DNADNA導入受體導入受體( (棉花棉花) )細胞細胞主要來源：主要來源：2.種類與命名：種類與命名：3.作用：作用：4.作用結果：作用結果：主要是從主要是從原核生物原核生物中分離純化出來中分離純化出來的一類酶。的一類酶。約約4000種種識別特定的核苷酸序列，斷裂磷酸二酯鍵識別特定的核苷酸序列，斷裂磷酸二酯鍵。形成粘性末

5、端或平末端形成粘性末端或平末端go back 現在已經從約現在已經從約300300種微生物中分離出約種微生物中分離出約40004000種種限制性內切酶限制性內切酶( (限制酶限制酶) )。粘質沙雷氏桿菌粘質沙雷氏桿菌（Serratia marcesens練習：流感嗜血桿菌的練習：流感嗜血桿菌的d d菌株菌株( Haemophilus influenzae d )( Haemophilus influenzae d )中先后分離到中先后分離到3 3種限制酶，則分種限制酶，則分別命名為別命名為: :Hind、Hind和和Hind能被限制性內切酶特能被限制性內切酶特異性識別的切割部位異性識別的切割部

6、位都具有都具有回文序列回文序列：在切割部位，一條鏈在切割部位，一條鏈正向正向讀的堿基順序與讀的堿基順序與另一條鏈另一條鏈反向反向讀的順讀的順序完全序完全一致一致。限制性核酸內切酶作用的是限制性核酸內切酶作用的是DNADNA分子中的什么鍵？分子中的什么鍵？磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵即脫氧核糖、磷即脫氧核糖、磷酸之間的連接酸之間的連接 GP AP A GGo back黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端平末端平末端限制酶DNA解旋酶區(qū)別切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵的磷酸二酯鍵將將DNADNA兩條鏈的氫鍵兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈打開形成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)別切割

7、切割特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵的磷酸二酯鍵，形成片，形成片段的段的DNA.DNA.（雙鏈）（雙鏈）切割磷酸二酯鍵，形成切割磷酸二酯鍵，形成單個的脫氧核苷酸。單個的脫氧核苷酸。目的基因所在目的基因所在DNADNA片段片段載體載體DNADNA片段片段催化催化形成形成 Ecoli DNA連接酶連接酶 T4 DNA連接酶連接酶 可把黏性末端之間的可把黏性末端之間的縫隙縫隙“縫合縫合”起來，起來，Ecoli DNA連接酶或連接酶或T4DNA連接酶連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合

8、酶是一回事嗎？聚合酶是一回事嗎？T T4 4 DNA DNA連接酶連接酶還可把還可把平末端之間的縫隙平末端之間的縫隙“縫合縫合”起來，但效率較低起來，但效率較低DNADNA連接酶連接酶DNADNA聚合酶聚合酶連接連接DNADNA鏈鏈連接部位連接部位相同點相同點雙鏈雙鏈單鏈單鏈在兩在兩DNADNA片段之間形片段之間形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加將單個核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3 3末端的末端的羥基上，形成磷羥基上，形成磷酸二酯鍵酸二酯鍵都能形成磷酸二酯鍵都能形成磷酸二酯鍵二者都是蛋白質類化合物二者都是蛋白質類化合物嘗試寫出下列序列受嘗試寫出下列序列受EcoRI限制

9、酶作用后的黏性末端限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT 1.作用：作用：2.條件條件：3.種類：質粒、種類：質粒、噬菌體的衍生物和動植物噬菌體的衍生物和動植物病毒等。病毒等。將外源基因送入受體細胞。將外源基因送入受體細胞。 有1多個限制酶切點對受體細胞無害使導入基因能在受體細胞中復制、表達有某些標記基因，便于篩選假如目的基因導入受體細胞后不能復制或不能轉錄，轉基因生物能有預想的效果嗎？作為分子運輸車載體，如果沒有切割位點將會怎樣？霍亂菌的質粒多個限制酶切點，你會用它來做分霍亂菌的質粒多個限制酶切點，你會用它來做分子運輸車嗎？子運輸車嗎？目

10、的基因有沒有進入受體細胞，如何去發(fā)現？目的基因有沒有進入受體細胞，如何去發(fā)現？ 作為載體的必要條件作為載體的必要條件:Go back質粒的特點：質粒的特點：是一種裸露的、結構是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬簡單、獨立于細菌擬核核DNADNA分子外并能分子外并能自自我復制我復制的小型的小型雙鏈環(huán)雙鏈環(huán)狀狀DNADNA分子。分子。能復制并帶著插能復制并帶著插入的目的基因一入的目的基因一起復制起復制有切割位點有切割位點有標記基因的存有標記基因的存在，將來可用含在，將來可用含青霉素的培養(yǎng)基青霉素的培養(yǎng)基鑒別。鑒別?；蚬こ袒蚬こ痰墓ぞ叩墓ぞ呦拗泼赶拗泼钢饕嬖谟谠松镏兄饕嬖谟谠松镏芯哂?/p>

11、專一性具有專一性( (識別序列識別序列) )切開切開DNADNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵DNADNA連連接酶接酶連接磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵種類種類E.coliDNAE.coliDNA連接酶連接酶T T4 4 DNA DNA連接酶連接酶載體載體具備的具備的條件條件質粒、質粒、噬菌體衍生物、噬菌體衍生物、動植物病毒動植物病毒種類種類能自我復制能自我復制有一個或多個酶切割位點有一個或多個酶切割位點有標記基因有標記基因對受體細胞無害對受體細胞無害1)不屬于質粒被選為基因運載體的理由是不屬于質粒被選為基因運載體的理由是 A、能復制、能復制 （ ） B、有多個限制酶切點、有多個限制酶切點 C、具

12、有標記基因、具有標記基因 D、它是環(huán)狀、它是環(huán)狀DNA2）有關基因工程的敘述中，正確的是（）有關基因工程的敘述中，正確的是（ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的、所有的限制酶只能識別一種特定的 核苷酸序列核苷酸序列 B、質粒是基因工程中唯一的載體、質粒是基因工程中唯一的載體 C、載體必須具備的條件之一是：具有、載體必須具備的條件之一是：具有 多個限制酶多個限制酶 切點，以便與目的基因連接切點，以便與目的基因連接 D、DNA連接酶使黏性末端的堿基之間連接酶使黏性末端的堿基之間 形成氫鍵形成氫鍵練習練習3 3）同一種限制酶切割成的黏性末端是）同一種限制酶切割成的黏性末端是 A. B. C. D. A（1010江蘇卷）江蘇卷）4.下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖l、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題： （1）一個圖1所示的質粒分子經Sma 切割前后，分別含有 個游離的磷酸基團。 （2）若對圖中質粒進行改造，插入的Sma酶切位點越多，質粒的熱穩(wěn)定性越 。 （1）0、2 （2）高 （3）用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用Sma 切割，原因是