鏈霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

1、鏈霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法定量測(cè)定蜂蜜、肉類及牛奶中的鏈霉素殘留。試劑盒中包括了所有檢測(cè)用的試劑。該試劑盒有96個(gè)試驗(yàn)孔包括標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，如果進(jìn)行定量分析，必須有微孔板酶標(biāo)儀。1概要 鏈霉素是一種被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖的抗生素。高濃度的鏈霉素會(huì)產(chǎn)生耳毒性及危害腎臟功能等嚴(yán)重的副作用。為了保護(hù)消費(fèi)者的身體健康,歐盟和美國(guó)規(guī)定在動(dòng)物性食品中的鏈霉素殘留量牛奶不得超過(guò)200ppb, 蜂蜜不得超過(guò)20ppb，肌肉與肝臟不得超過(guò)500ppb。過(guò)去鏈霉素殘留一般采用氣相色譜法測(cè)定。但此方法昂貴又費(fèi)時(shí)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒則可通過(guò)快速簡(jiǎn)便的樣品制備，檢測(cè)蜂蜜、牛奶及組織中的鏈霉素。2測(cè)

2、定原理 測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有抗鏈霉素的抗體。加入鏈霉素酶標(biāo)記物，鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。游離鏈霉素與鏈霉素酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)鏈霉素抗體結(jié)合位點(diǎn)（競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫分析）。沒(méi)有結(jié)合的鏈霉素酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去將酶基質(zhì)（過(guò)氧化脲）和發(fā)色劑/四甲基聯(lián)苯胺）；加入到孔中并且孵育。結(jié)合的鏈霉素酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后便顏色由益轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nrn處測(cè)量（選擇參比波長(zhǎng)600nm）。吸光度值與樣品中的鏈霉素濃度成反比。3試劑盒提供的試劑每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)量（包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定孔），盒中的材料如下：1X 96孔板 (12X8孔) 包被有抗鏈霉素抗體6X鏈

3、霉素標(biāo)準(zhǔn)液,2ml/瓶1X過(guò)化物酶標(biāo)記的鏈霉素濃縮液（藍(lán)色溶液）1X底物（7ml）含有過(guò)氧化脲（粉紅色溶液）1X顯色劑（7ml）四甲基聯(lián)苯胺1X反應(yīng)終止液（8ml）1M硫酸1X PBS濃縮液 (15ml),，用于酶標(biāo)記物稀釋1X PBST濃縮液 (40ml)，加800ml蒸餾水稀釋，用于洗板4需要的材料但盒中不提供4l 設(shè)備微孔板酶標(biāo)儀（450nm）一均質(zhì)器一離心機(jī)一恒溫培養(yǎng)箱一振蕩器10ml玻璃離心管一刻度移液管一50l，100l，1000l微量加液器42 試劑一正己烷一PBS-吐溫緩沖液 (0.55 g NaH2PO4 x H2O + 2.85 g Na2HPO4 x 2 H2O + 9

4、g NaCl + 0.1 % 吐溫-80, 加 1000 ml 雙蒸水）一肝組織處理液I：0.36M亞鐵氰化鉀X 3H2O一肝組織處理液II：1.04 M硫酸鋅X 7H2O5操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)一反應(yīng)停止液為IM硫酸，避免接觸皮膚一不要使用過(guò)了有效日期的試劑，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度的降低不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑6儲(chǔ)存條件一保存試劑盒子28不要冷凍。一無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。一將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封。7試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.6個(gè)單位（A450nm）時(shí)表示試劑可能變質(zhì)

5、。8樣品處理樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存1. 取1 g蜂蜜，放入離心管中，加入4.5ml雙蒸水。2. 上下振蕩使之完全溶解。（建議用80熱水溫浴試管，溶解更快更充分）3. （原料蜜3000 g離心5分鐘）取上清50l進(jìn)行分析。1. 用均質(zhì)器均質(zhì)樣品。2. 稱5g均質(zhì)過(guò)的樣品加入20ml PBS 吐溫緩沖液強(qiáng)力混勻。3. 室溫4000 g離心10分鐘。(高脂肪樣品需離心后取上層液體5ml加入3ml正己烷,強(qiáng)烈振蕩5分鐘。 室溫4000g離心10分鐘，去除頂部的脂肪層)。4. 取出上層液體用PBS-吐溫緩沖液稀釋1:10 （例50l樣品液加450l緩沖液）。5. 取50l進(jìn)行分析。8.4

6、.肝臟樣品1如8.2-4稀釋后，移出4ml上清液至玻璃試管。2加II 溶液，再加入0.8ml雙蒸水，混勻幾秒鐘。3室溫4000g離心10分鐘。4同8.22高脂肪肉類樣品方法去除脂肪（去除上層2ml液體）。5取水相，用PBS-吐溫緩沖液1:8稀釋（例100l樣品液+700l吐溫緩沖液）。6取50 l 分析測(cè)定。1. 用PBS-吐溫緩沖液稀釋牛奶 1:20 (例. 50 l 牛奶 + 950 l 緩沖液)。2. 取50l上清液進(jìn)行分析。 9酶標(biāo)免疫分析程序（室溫2025條件下操作）9l測(cè)定之前注意事項(xiàng)1使用之前將所有試劑回升至重溫 2025。2使用之后立即將所有試劑放回28。3在使用中不要讓微孔干

7、燥。4在ELA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是ELA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。5在所有恒溫孵育過(guò)程應(yīng)避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。 92 酶標(biāo)記物與微孔板條a) 鏈霉素酶標(biāo)記物為濃縮液。由于稀釋的酶標(biāo)記物穩(wěn)定性不好，所以只稀釋實(shí)際需用量的酶標(biāo)記物1：15稀釋（1l酶標(biāo)液加14l PBS緩沖液）。在吸取濃縮液之前，要仔細(xì)地振搖，剩余的仍放置2-8保存。b) 微孔板條取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板用膠帶封好，放進(jìn)原袋中重新密封，2-8保存。93 標(biāo)準(zhǔn)液提供的鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0, 0.67, 2.0, 6.0, , ppb (ng/ml)94 測(cè)定程

8、序（室溫20-25條件下操作）a) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。倒出孔中的抗體液，用PBST洗滌三次。每次洗板應(yīng)加入洗液后等2分鐘再倒掉。加入50l的標(biāo)準(zhǔn)液或處理好的樣品到各自的微孔中。加入100l稀釋的酶標(biāo)記物到微孔底部，25-30孵育30分鐘。倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250l PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復(fù)操作兩次。每次洗板應(yīng)加入洗液后等2分鐘再倒掉。反應(yīng)底物與顯色試劑以1:1混合后加入100l到微孔中，充分混合并在25-30暗處孵育30分鐘。加入50

9、l反應(yīng)停止液到微孔中，混合好在450nm 處測(cè)量吸光度值，必須在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。10結(jié)果所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值再乘以100，因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100%并且以百分比的形式給出吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值（或樣品）- 100 = %吸光度值0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的值并繪成為一個(gè)對(duì)應(yīng)鏈霉素濃度（ng/g或ng/ml）為半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在-ng/g(ppb)范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度（ng/g或ng/ml）可以從校正曲線上讀出。請(qǐng)注意為了獲得樣品中的鏈霉素的實(shí)際濃度（ng/g）從校正的線上讀出的濃度位必須乘以相對(duì)應(yīng)的稀釋系數(shù)當(dāng)樣品處理過(guò)程是按指示進(jìn)行的，稀釋系數(shù)如下；蜂蜜 5牛奶20肉類、組織 50 11靈敏度鏈霉素試劑盒的平均檢測(cè)下限約為0.5ppb。12特異性鏈霉素試劑盒的特異性通過(guò)對(duì)相應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)性分析而得到。鏈霉素 100%與慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、青霉素、四環(huán)素