超聲乳化法構建化妝品用熊果苷透明質酸-己二酸二酰肼交聯(lián)載藥微球

1、超聲乳化法構建化妝品用熊果苷/透明質酸-己二酸二酰肼交聯(lián)載藥微球                  作者：高瑞英 傅中 慕丹 李震【摘要】  目的研究熊果苷/透明質酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)交聯(lián)載藥微球的制備及性能測定。方法采用超聲乳化法，以透明質酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)交聯(lián)衍生物為載體，制備熊果苷/HA-ADH微球。通過倒置生物顯微鏡、紅外光譜儀、紫外分光光度計等對載藥微球的形貌結構進行表征，并考察其

2、載藥量、包封率及體外釋藥性能。結果制備的熊果苷/HA-ADH微球成球和分散性好，載藥量(DL%)為(8.33±1.52)%，包封率(LE)%為(67.37±1.64)%。較大的微球粒徑、孔徑，負載量高時具有較好的緩釋效果，釋放介質溫度的變化對其釋放行為影響較小。結論HA-ADH載藥微球對熊果苷有較好的緩釋效果，作為新型美白化妝品功能原料有較大的開發(fā)潛力。 【關鍵詞】  超聲乳化法; 熊果苷; 透明質酸-己二酸二酰肼; 微球; 制備化妝品中的活性成分要達到營養(yǎng)、改善皮膚狀況和預防皮膚疾病的功效，關鍵是活性物質必須透過角質層而達到相應的作用部位并維持一定的時間。因此，

3、尋找促進功能性成分經(jīng)皮吸收的方法成為開發(fā)療效性化妝品的關鍵之一。天然高分子聚合物微球超微載體技術應用于化妝品生產(chǎn)，賦予了化妝品優(yōu)異性能17。透明質酸(Hyaluronic Acid，HA)是細胞外基質中廣泛存在的蛋白多糖成分(分子結構見圖1)，具有良好的生物相容性，有望成為理想的緩釋、控釋功效成分的載體材料。但是，純HA易溶于水、吸收迅速和在組織中停留時間短等物理和生物特性，限制其作為功能成分載體的使用，需要使用化學交聯(lián)修飾，以增大其分子量、延長降解時間，提高穩(wěn)定性814。熊果苷(arbutin) 是高效的化妝品美白原料，它在人體內(nèi)通過抑制酪氨酸酶活性來阻斷黑色素前體多巴以及多巴醌的合成，有較

4、好的美白效果。但將熊果苷直接添加到化妝品配方中，其透皮吸收能力不甚理想15，16。熊果苷的物理性狀為白色針狀結晶或粉末，易溶于熱水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等，熔點：198201，在酸性條件下不穩(wěn)定，易被水解。熊果苷有兩種差相異構體，即及型。分子結構為見圖2。圖1 透明質酸分子結構-熊果苷 -熊果苷圖2 熊果苷分子結構近年來，超聲乳化法在現(xiàn)代生物技術中得到了廣泛的應用。超聲能對不相溶的液-液和液-固非均相體系作用，從而使介質分子達到最大的分散效應。液體介質中，由于渦流或超聲波的物理作用，液體中的某一區(qū)域會形成暫時負壓區(qū)，這種空化氣泡在液體介質中產(chǎn)生、潰陷或消

5、失而形成空化作用。超聲乳化被較普遍地認為是空化作用的結果17，18。本研究采用超聲乳化法，以生物相容性極佳的己二酸二酰肼(ADH)作交聯(lián)劑，制備HA-ADH凝膠，用于包裹熊果苷等美白功效成分，形成天然高分子聚合物微球，增強熊果苷的透皮吸收能力，并達到緩釋和提高生物利用度等作用，為化妝品皮膚美白產(chǎn)品提供新型功效性原料。使用紫外-可見分光光度法考察微球在PBS緩沖液中的釋藥效能。1 材料與儀器1.1 材料熊果苷標準品(湖北襄西化學工業(yè)有限公司，化妝品級)，透明質酸(山東福瑞達生物化工有限公司，化妝品級)，已二酸二酰肼(ADH，海曲化工有限公司)，氫氧化鈉(NaOH)、氯化鈉(NaCl)，液體石蠟(

6、白油)，異丙醇，Span-80，Tween-80，氯化鉀(KCl)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，磷酸二氫鉀(KH2PO4)。試劑除注明外均為分析純，實驗用水為雙蒸水。PBS緩沖液，參照中國藥典(2005年版)配制，pH值為7.319。熊果苷樣品標準溶液，以PBS緩沖液為溶劑，用熊果苷標準品配制濃度分別為1,2,5,10,15,20,25和30g/ml的樣品標準溶液。1.2 儀器分析天平，超聲波細胞粉碎機，低速離心機，恒溫振蕩器，TP2A型透皮擴散實驗儀，移液器(1001 000 l)，真空干燥箱，磁力攪拌器，紫外分光光度計，倒置生物顯微鏡、紅外光譜儀。2 方法2.1 藥物標準曲線的繪制使用紫

7、外分光光度計，在190400 nm波長范圍對20 g/ml濃度的熊果苷樣品溶液進行掃描，確定最大吸收波長max。PBS溶液作空白對照，于最大吸收波長max處測定不同濃度C熊果苷樣品標準溶液的吸收度值A，以A對C作標準曲線。2.2 熊果苷/HA-ADH微球的制備流程在濃度為1mol/L的NaCl溶液中溶解一定量的熊果苷用量熊果苷/HA=110(g/g)，配制濃度為0.2%的HA水溶液(CHA)，待溶脹至均勻透明后加入熊果苷/NaCl溶液，用2.5 mol/L的NaOH濃溶液調(diào)pH至9。水相中，HA、熊果苷/NaCl和NaOH溶液分別占77%，20%和2%。以液體石蠟為油相介質，加入乳化劑/油相為

8、1/100(g/g)的復配乳化劑(Span-80Tween-80=8812, V/V)。以水相和油相W/O=1/4(V/V)配成240 ml濁液，加入濃度為0.1%、占水相體積1%的ADH溶液，經(jīng)400 W聲波乳化，工作時間10 s×90次，間歇10 s。用磁力攪拌器攪拌4 h待交聯(lián)反應基本充分。靜置至產(chǎn)物分層，取水相層上方白色乳濁液用異丙醇少量多次洗滌，真空干燥箱中干燥至恒重備用20，21。制備流程見圖3。圖3 熊果苷/HA-ADH微球的制備流程2.3 熊果苷/HA-ADH微球的表征2.3.1 熊果苷/HA-ADH微球的表觀形態(tài)觀察將熊果苷/HA-ADH微球乳液滴在載玻片上成單層，

9、自然烘干，400×鏡下和1000×油鏡下觀察微球形態(tài)并拍照。2.3.2 紅外光譜分析將干燥的熊果苷原粉、HA-ADH空白微球及熊果苷/HA-ADH微球研磨成粉末，通過KBr壓片法制成薄片，用傅立葉紅外光譜儀測定產(chǎn)物的紅外圖譜，分辨率為4cm-1，掃描16次，進行圖譜比較?？疾旎钚越M分與聚合物之間的相互作用。2.4 載藥量和包封率的測定采用酶解法處理樣品，按加入乙醇后的酶解體積推算熊果苷濃度測定值。按式和式計算微球的載藥量(DL%)和包封率(LE%)。微球載藥量(%)=微球中藥物的質量微球的質量×100%微球包封率(%)=微球中藥物的質量投藥總質量×100

10、%2.5 熊果苷/HA-ADH微球的釋藥性能取負載有活性組分的多孔微球0.5g，用適量pH=7.3的PBS緩沖液分散后，采用TP2A型智能透皮儀測定載藥微球釋放的活性物濃度。棄去每次取出的溶液，然后向接收池中補充等量的新鮮磷酸鹽緩沖液，以維持接收介質的體積不變?；钚晕锏尼尫懦掷m(xù)10 h，按時間間隔和累積釋放百分比得到活性物的釋放曲線。按式計算累積釋放率：累積釋放率(%)=(ni=1V×Ci/W)×100%式中Ci為釋放介質中活性物的濃度(mg/ml)，V為每次取樣的體積，針對本文為10 ml，W為總的載藥量(mg)。3 結果與討論3.1 熊果苷/HA-ADH微球的表征3.1

11、.1 熊果苷/HA-ADH微球的表觀形態(tài)觀察部分光鏡和油鏡下的微球形態(tài)顯微照片如圖4所示。A-光鏡，400× B-油鏡，1 000×圖4 熊果苷/HA-ADH微球經(jīng)干燥后顯微鏡照片光鏡及油鏡下可見，熊果苷/HA-ADH微球成球性和分散性好，干燥后可達納米級。3.1.2 紅外光譜分析圖5分別為熊果苷與空白HA-ADH微球、吸附后HA-ADH微球的紅外譜圖，發(fā)現(xiàn)吸附后的微球上均沒有明顯的新峰出現(xiàn)，說明活性物在微球上的吸附主要為物理吸附。圖5 熊果苷、空白微球及載藥微球紅外光譜分析圖空白及吸附后的HA-ADH微球在吸收頻率為1 690 cm-1和1 600 cm-1處有強吸收峰，

12、說明生成了-CO-NR2的結構，標志著交聯(lián)反應的發(fā)生。3.2 熊果苷標準曲線本方法采用酶解法盡量降低HA的分子量，使其中的熊果苷充分釋放，再用乙醇沉淀糖類物質，離心后的清液中沒有糖類物質，對紫外分光光度計的藥物吸收測量沒有影響。經(jīng)測定，熊果苷最大吸收波長為max=280 nm。繪制熊果苷標準曲線，回歸方程為：Y=0.088 95+6.34 368X，Y為吸光度，X為熊果苷濃度(g/ml)。在吸光度Y=0.1971.295之間，相關系數(shù)R=0.998 76。3.3 載藥量和包封率的測定結果經(jīng)測定，本方法制備的載藥微球載藥量(DL%)為(8.33±1.52)%，包封率(LE)%為(67.

13、37±1.64)%(n=5)。熊果苷為水溶性功效物質，在微球制備過程中以包埋機制與HA-ADH微球結合。當超聲波將HA和熊果苷的溶液(水相)乳化后，由于ADH對HA發(fā)生的是緩慢交聯(lián)，微球中的熊果苷仍處于被物理包埋與游離于乳液中不斷變換的動態(tài)環(huán)境。在這個過程中，粒徑小的微球比表面積大，能接觸更多的熊果苷分子，從而使包埋效率提高。而粒徑大的微球包埋率則相對較低。熊果苷分子一旦被HA包埋，由于ADH的交聯(lián)作用，HA的粒徑處在一直收縮的過程中，孔隙變小，又會對ADH的包埋起到緊實的作用。因此，對多個微球而言，熊果苷游離出HA微球中的量總是小于HA微球在同一時刻對其包埋的量。3.4 熊果苷/H

14、A-ADH的釋藥性能3.4.1 熊果苷/HA-ADH微球的突釋和緩釋效應圖69為熊果苷/HA-ADH微球不同情況下累積釋藥率隨時間的變化關系。熊果苷是極性較強的物質，且與水的親和能力強，在水中的溶解度很大。從圖中可以看出，載藥微球中熊果苷的釋藥速率明顯低于自然熊果苷的溶解速率，達到了緩釋的效果。另外，載藥微球中的熊果苷，均存在剛開始“突釋”，隨后勻速釋放的現(xiàn)象?！巴会尅笔俏皆谖⑶虮砻娴男芄障蚪橘|中快速擴散的結果。釋藥過程中熊果苷/HA-ADH發(fā)生顯著溶脹，凝膠骨架變得疏松，為內(nèi)部藥物釋放提供通道。此時由于釋藥空間的增大，藥物量的減少，釋放速率將變慢。 最后，HA-ADH在水中分散成絮狀物質

15、，懸浮在水中，并不溶解。3.4.2 載藥微球性能對釋放行為的影響在活性物釋放的過程中，通常是微球中被吸附的活性物首先經(jīng)過水溶解，之后溶解的活性物由于濃度梯度的存在而擴散到接受介質中。對于熊果苷來說，它在水中的溶解度很大，因此它的釋放主要受擴散控制。在負載量一定的情況下，研究不同的微球粒徑對熊果苷釋放性能的影響，結果如圖6所示。可以看出，隨著微球粒徑的減小，載有活性物的微球體外釋放的速率和最終的平衡釋放率均增加。不同孔徑對負載熊果苷多孔聚合物微球的累積釋放百分率的影響見圖7。對于多孔的聚合物載體來說，孔徑是被負載活性物擴散釋放的通道。實驗結果顯示，孔徑越大，釋放速度越快。圖6 微球粒徑對熊果苷釋

16、放性能的影響圖7 微球孔徑對熊果苷釋放性能的影響圖8 不同負載量對熊果苷釋放性能的影響圖9 不同溫度對熊果苷釋放性能的影響3.4.3 負載量對釋放行為的影響在其它條件相同的情況下，改變活性物熊果苷的添加量，制備了負載量分別為20%，35%和50%的多孔聚合物微球，考察其體外釋放行為，并與自然熊果苷(原粉)進行對照，結果如圖8所示?？梢钥闯觯d藥微球負載量越低，其突釋現(xiàn)象更為明顯，第2小時時已可釋放載藥總量的42%，突釋量占總釋放量的45%以上。其原因可能在于熊果苷是極性較強的物質，與水有較好的親和力，再加上熊果苷在釋放介質中的溶解度較大，導致釋放速率較快?？偟膩砜矗d藥量高的微球具有更長的緩釋

17、時間。3.4.4 溫度對釋放行為的影響在負載量一定的情況下，在2537范圍內(nèi)研究溫度對熊果苷體外釋放行為的影響，結果如圖9所示?？梢钥闯觯瑴囟葘π芄盏尼尫判袨樯杂杏绊?，溫度越高，釋放率越高。這是因為較高的溫度有利于分子的擴散。4 結論本實驗采用超聲乳化法選擇油包水W/O乳液體系，以熊果苷為被包裹功效成分，成功制備了熊果苷/HA-ADH微球，成球性和分散性良好。微球載藥量(DL%)為(8.33±1.52)%，包封率LE%為(67.37±1.64)%(n=5)。實驗還對所制得的載藥多孔微球的體外釋放行為進行了研究。結果表明，熊果苷/HA-ADH微球對其有較好的緩釋作用。微球粒

18、徑較大和負載量高時具有較好的緩釋效果，孔徑對其釋放行為也有一定影響，孔徑大的具有更快的釋放速度;釋放介質溫度的變化對其釋放行為影響較小。與傳統(tǒng)的化妝品配方相比，將多孔聚合物微球系統(tǒng)應用于化妝品中，可以將其中的活性組分緩慢釋放到皮膚表面，以達到長時間維持有效濃度、降低毒副作用等目的。另外，多孔聚合物微球的透氣性和保濕性，使它能夠很好的與皮膚相容。研究微球結構、活性物性質和釋放性能的基本規(guī)律對于指導化妝品用功效原料的制備，開發(fā)適合的透皮吸收緩釋載體具有指導意義?！緟⒖嘉墨I】  1 林 婕, 何聰芬, 董銀卯，等. 化妝品功效成分的透皮吸收途徑與技術J. 中國化妝品, 2009,2: 90

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