畢業(yè)論文-雞胚孵化過程中膽固醇含量的變化的研究-dll-2

1、摘 要雞胚孵化過程中膽固醇含量變化規(guī)律的研究食品與生物工程學(xué)院 程鵬真指導(dǎo)教師 李松彪摘要雞蛋是營養(yǎng)豐富的食品之一，營養(yǎng)含量高，易于被人體吸收，是人們?nèi)粘ｏ嬍持衅毡橄矚g的食品。禽蛋中含有大量膽固醇，人體每天攝入量過多，可形成高脂血癥，引起動脈粥樣硬化，進(jìn)而誘發(fā)冠心病、高血壓等一系列心腦血管疾病。雞胚孵化過程中，膽固醇含量下降，其他營養(yǎng)物質(zhì)含量升高。因此，我對雞胚膽固醇含量進(jìn)行了比較分析，以期為社區(qū)人群和心腦血管疾病病人合理食用禽蛋食品提供依據(jù)。我使用直接皂化比色法，測定標(biāo)準(zhǔn)品繪制出作為參照的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后取不同胚齡的雞胚蛋經(jīng)過處理，使用直接皂化比色法測定各個(gè)樣品中膽固醇含量。直接皂化比色

2、法，將比色法改進(jìn)后定量測定雞胚蛋中膽固醇含量，樣品處理比已有的方法簡單、準(zhǔn)確。結(jié)果顯示孵化期間雞蛋膽固醇含量在06胚齡下降較慢，以后下降速度較快。根據(jù)此結(jié)果可知，在食用禽蛋時(shí)，為了降低膽固醇的攝入量可以在個(gè)人能接收的條件下適當(dāng)?shù)氖秤门啐g在1221天的孵化過程中的禽蛋或禽蛋制品。關(guān) 鍵 詞：雞胚；孵化；膽固醇；直接皂化比色I(xiàn)IABSTRACTStudy of the Cholesterol Content of chicken Eggs during the HatchFood and biological engineering college Cheng Peng zhenTutor Li

3、Song biaoABSTRACTThe eggs are nutritious, and they have high nutritional content which are easily absorbed by the people, and they are the food which people like to eat in their daily life. But a lot of cholesterol is contained in the yolk. If too much cholesterol is taken in, hyperlipidemia can be

4、got, leading to arteriosclerosis, and cardiovascular and cerebrovascular diseases, like coronary heart disease, and high blood pressure. But during the hatching process of eggs, the cholesterol levels will decline, but the other nutrients content will increase. Therefore, I make contrast and analysi

5、s of the cholesterol contained in eggs , in order to provide evidences to eat eggs properly for community population and patients with cardiovascular and cerebrovascular diseases.Here directsaponification colorimetric method is used, and samples are determined to graph the standard curve of choleste

6、rol as a reference. And then eggs with different ages are coped with directsaponification colorimetric method to determine the cholesterol contents in all the samples. In directsaponification colorimetricmethod,Themethodimprovedquantitativedetermination of cholesterolin eggs,sample processingthan th

7、e existingmethod is simple,accurate. The cholesterol content of eggs was determined by this method. The conclusion showed that the cholesterol content of eggs and quail eggs fall slowly in the first six days of the hatch, and then fall quickly. According to its conclusion, when eating eggs, in order

8、 to reduce the cholesterol content, eggs and egg product can be eaten from 12 to 21 days of the hatch in the condition which individuals can accept.KEY WORDS：ckicken eggs; hatch; cholesterol; the directcreator ofcolorimetric method.目 錄目錄前 言6第1章 文獻(xiàn)綜述81.1膽固醇概述81.2測定雞胚中膽固醇含量方法的研究91.2.1比色法測定禽蛋中膽固醇含量91.2

9、.2高效液相色譜法測禽蛋中膽固醇含量101.2.3酶法測定禽蛋中膽固醇含量111.2.4方法比較111.3禽胚孵化過程中膽固醇含量變化的研究12第2章 材料與方法132.1材料132.1.1實(shí)驗(yàn)儀器132.1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑132.1.3雞胚蛋132.2方法132.2.1 雞蛋膽固醇的提取與測定132.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制142.2.3 精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)152.2.4 回收率試驗(yàn)15第3章 結(jié)果與分析163.1實(shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)確性矯正163.2波長的選擇163.3顯色劑用量試驗(yàn)163.4雞蛋孵化期間膽固醇含量的變化173.5膽固醇穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)183.6加標(biāo)回收率測定實(shí)驗(yàn)18 3.7實(shí)驗(yàn)誤差.19第

10、4章 結(jié)論20參考文獻(xiàn)21致謝23IV前 言前 言雞蛋是我們?nèi)粘Ｉ攀持卸喾N營養(yǎng)的重要來源，是居民日常生活中從飲食補(bǔ)充膽固醇、VA和VE的主要來源。膽固醇是生物膜的重要成分，又是合成膽汁酸、類固醇激素以及VD等生理活性物質(zhì)的原料。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，天然膽固醇有抗癌功能。同時(shí)，腎上腺皮質(zhì)激素、雄激素及雌激素等體內(nèi)許多重要的激素，也均以膽固醇為原料在相應(yīng)的內(nèi)分泌細(xì)胞中合成。另外，膽固醇也是人體不可缺少的營養(yǎng)成分。其廣泛分布在人和動物的各種組織中，其在人體內(nèi)含量約為140g，是維持人體機(jī)體正常生理功能所必需的重要物質(zhì)。機(jī)體內(nèi)膽固醇主要來源于內(nèi)源性合成和外源性吸收。內(nèi)源性膽固醇主要在肝臟合成，每天約合

11、成1g。外源性膽固醇吸收量受飲食結(jié)構(gòu)影響，其中營養(yǎng)豐富的禽蛋類食品含有大量膽固醇，是外源性膽固醇的主要來源。然而膽固醇在人體內(nèi)的新陳代謝主要靠肝臟來實(shí)現(xiàn)，營養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為，當(dāng)膽固醇和飽和脂肪酸結(jié)合成低密度脂蛋白、而且當(dāng)?shù)兔芏饶懝檀级嘤谏眢w所需要的時(shí)候，它就容易沉積、附著在動脈血管壁上，使血液中膽固醇含量增加，促使血管硬化，造成動脈血管阻塞，誘發(fā)心血管病，嚴(yán)重時(shí)將造成死亡。另外，膽固醇還會在膽道中沉積為膽結(jié)石。膽固醇過高并非罕見，綜合全球各地的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，大約有15%25%的人，血漿膽固醇濃度在240mg/dl之上，使他們患冠心病的概率大大增加，所以膽固醇過高表示身體健康已經(jīng)亮起了紅燈，但可怕的是

12、，就算體內(nèi)膽固醇過高，大多數(shù)人也沒有癥狀。因此定期檢查身體內(nèi)膽固醇濃度以及控制飲食中膽固醇攝入量非常必要。適度控制外源性膽固醇攝入，也就成了預(yù)防動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的重要措施。隨著人們對膽固醇及其酯類在動脈粥樣硬化的發(fā)生所起的生理作用的認(rèn)識，對不同食物中膽固醇的分布及決定膽固醇含量的因素已引起了廣泛的關(guān)注。鑒于膽固醇類組分對人體的影響，人們不斷采取各種各樣的手段來減少食物組分中膽固醇的含量，這就要求建立一種簡單、快速而重現(xiàn)性又好的測定膽固醇的方法。美國心臟病研究會（1986）推薦，人體每天膽固醇攝入量不應(yīng)超過 300mg，以減少高脂血癥和冠心病等心腦血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。膳食膽固醇主要來源

13、于動物性食物，而禽蛋是動物性食品中膽固醇含量較高的一種。雞胚蛋是受精禽蛋孵化至一定天數(shù)后，還未破殼，可食用的禽蛋。禽胚在短短21天眾發(fā)育成一個(gè)獨(dú)立個(gè)體，發(fā)育過程中，所需要的水分、營養(yǎng)物質(zhì)全部來源于卵黃囊和卵清，僅僅需要外界提供一定的溫度、濕度。在發(fā)育過程中，生長因子、酶類在體液中表達(dá)、發(fā)揮其生理功能，協(xié)調(diào)完成雞胚發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂增殖、組織器官形成等不同層次的生命活動。因此，雞胚蛋的胚胎在生長發(fā)育過程中其各種營養(yǎng)成分均有較大的變化。在全蛋構(gòu)造中蛋黃既是禽類胚胎發(fā)育的主要營養(yǎng)來源又是蛋殼等其他組分中某些營養(yǎng)成分被胚胎吸收利用的中轉(zhuǎn)樞紐，對胚胎的生長發(fā)育具有重要作用。孵化期間隨著胚胎

14、的生長發(fā)育，蛋內(nèi)各組分的營養(yǎng)成分均有規(guī)律的進(jìn)行著代謝，弄清各種營養(yǎng)的代謝變化規(guī)律對調(diào)控禽類胚胎發(fā)育，提高孵化率等有重要意義。雞胚蛋含有特殊的活性成分，從受精蛋的胚胎活動開始，酶就開始作用，其蛋內(nèi)分解酶、淀粉酶、磷酸酶和溶菌酶參與孵化過程的物質(zhì)代謝。溶菌酶對人體的保健作用十分明顯，食用后可直接和間接提高人體抗病能力，促進(jìn)人體對蛋白的消化和吸收。雞胚蛋中溶菌酶活性在1019d內(nèi)可比鮮雞蛋提高近l倍，這一方面是雞胚自身代謝需要，另一方面提高雞胚自身抗病能力。為分析禽蛋類食品中膽固醇含量，探索開發(fā)低膽固醇禽蛋品種，指導(dǎo)心腦血管疾病高危人群合理飲食。目前測定膽固醇的方法主要有化學(xué)比色法、分光光度比色法、

15、酶測定法和色譜法等。分光光度法是測定膽固醇含量的傳統(tǒng)方法，用于雞蛋膽固醇測定時(shí)重現(xiàn)性良好，平均回收率在100.93%左右但是該法樣品的處理不可避免地要經(jīng)過皂化-萃取步驟，并以多步溶劑萃取進(jìn)行純化和濃縮1。酶測定法的特點(diǎn)是敏感、專一、快速，并能實(shí)現(xiàn)自動化分析，但酶法技術(shù)要求高，不適合作為常用的檢測方法；色譜法對試劑和儀器的要求高，并且儀器的維護(hù)費(fèi)用也相當(dāng)昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室難以承受，且操作步驟也比較復(fù)雜，難以推廣應(yīng)用；而化學(xué)比色法簡單易行，重現(xiàn)性好，在一般實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行。本研究建立了快速測定雞胚中膽固醇含量的直接皂化比色法。11第1章 文獻(xiàn)綜述第1章 文獻(xiàn)綜述1.1膽固醇概述膽固醇不可缺少，是動物

16、細(xì)胞各種細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及神經(jīng)髓鞘的重要組成部分，是膽汁酸、類固醇激素及維生素3的前體，具有重要的生理功能。來源于雞蛋中的膽固醇與來源于其它食品的膽固醇相比更易導(dǎo)致人體血清膽固醇水平的提高。美國心臟病研究會推薦人體每天膽固醇攝入量不應(yīng)超過300mg，也就是每天攝入雞蛋不要超過3個(gè)，以減少高脂血癥和冠心病的危險(xiǎn)2。雞蛋中膽固醇含量較高，為滿足不同人群的需要，低膽固醇雞蛋等具有一定保健功能的雞蛋受到人們的關(guān)注，因而有必要對雞蛋膽固醇含量進(jìn)行分析研究。蛋中膽固醇含量隨家禽品種或品系以及年齡的不同而變化，蛋黃膽固醇含量的遺傳力估值在0.210.26，這表明可通過遺傳選擇來改變蛋中膽固醇水平。王惠云等3報(bào)導(dǎo)，

17、一個(gè)白萊航雞群經(jīng)膽固醇選擇后的兩個(gè)亞雞群在選擇一代后，蛋黃膽固醇水平可有5.3%的顯著差異。陳家華等4在品系內(nèi)對蛋黃膽固醇水平作高和低的選擇，發(fā)現(xiàn)選擇的確有效。他們認(rèn)為，蛋黃膽固醇濃度存在著下限，因?yàn)槟懝檀紝Πl(fā)育中的胚胎有著多種用途，即自然選擇對于人工選擇低膽固醇有著反作用。許壯等5報(bào)告用白萊航雞群作蛋黃低膽固醇水平選擇，水平降低5.4%（每枚蛋減少9mg），但實(shí)踐意義不大。國內(nèi)的孫憲如先生6在比較白殼蛋雞和褐殼蛋雞的蛋黃膽固醇差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)差異顯著。Ali發(fā)現(xiàn)，非假性基因作用在蛋黃和血液膽固醇水平的遺傳中較為重要，他還發(fā)現(xiàn)，從基因型和表現(xiàn)型來看，產(chǎn)蛋率和蛋黃中膽固醇含量之間有顯著的負(fù)相關(guān)7。W

18、ashburn等發(fā)現(xiàn)，高膽固醇含量選擇系的蛋重和蛋黃重顯著大于水平低的。近來，通過育種選擇，雞蛋膽固醇含量已經(jīng)間接降低了，因?yàn)樵黾恿水a(chǎn)蛋率，產(chǎn)蛋量愈高，蛋的膽固醇含量也愈低8。又據(jù)有關(guān)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血漿甘油三酯與蛋中膽固醇含量有著中等程度以上的遺傳相關(guān)，因此可以把血漿中甘油三酯含量作為蛋中膽固醇含量的間接選擇性狀9。多年來人們一直致力于降低雞蛋中膽固醇含量的研究，對影響雞蛋中膽固醇沉淀的各種因素進(jìn)行試驗(yàn)、分析比較。有成功的結(jié)論，也有相反的看法。日糧中膽固醇和脂肪的改變可使蛋黃膽固醇下降25%以上，日糧纖維及藥物等一些添加劑對降低蛋黃膽固醇僅中等有效（5%10%），此外，還存在藥物或其他代謝物在蛋黃

19、中的殘留問題。在遺傳育種方面可通過甘油三脂這個(gè)間接性狀進(jìn)行選育，選育效果較好。關(guān)于蛋黃膽固醇含量的測定，現(xiàn)行的方法都較簡便易行，尤其是直接皂化法易于操作且精確度高。在去除食物中膽固醇方面的研究也較多，有CO2超臨界萃取、氧化酶降解以及乳酸融合子降解等方法。利用這幾種方法都可以有效的清除食物或蛋黃中的膽固醇，清除率都很高。1.2測定禽蛋中膽固醇含量方法的研究膽固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，試劑盒法是基于酶法測定膽固醇的原理進(jìn)行的，比色法是一種依據(jù)顯色反應(yīng)來分析的傳統(tǒng)方法，色譜法是適用范圍較廣、靈敏度較高的分析方法，而高效液相色譜不需要載氣，在使

20、用上較氣相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法簡便10-12。在此我們研究比色法和高效液相法討，分析它們的特點(diǎn)。1.2.1比色法測定禽蛋中膽固醇含量膽固醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取濃度為1 mgmL的膽固醇原液。在臨用時(shí)用甲醇稀釋成0.04 mgmL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)母液。吸取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)母液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL(相當(dāng)于膽固醇0、16、32、48、64、80 ug)分別移入25 mL比色管，用甲醇定容至2 mL，再沿管壁緩慢加入2 mL硫磷鐵顯色劑，迅速搖勻，冷卻至室溫后，以甲醇作空白用分光光度計(jì)在550 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)建立線性回歸方程13。取1枚雞胚蛋，打碎

21、攪勻。準(zhǔn)確稱取3 g雞胚勻液。置于25 mL比色管內(nèi)，加蒸餾水稀釋并定容至刻度搖勻。得到蛋黃稀釋液。準(zhǔn)確吸取1 mL蛋黃稀釋液于50mL燒杯中，加入3 mL 10氫氧化鉀溶液及10 mL無水乙醇溶液攪勻，在60水浴直接皂化1 h(每隔15 min攪拌1次)后取出，冷卻后置于一定溫度下水浴。加入一定量石油醚溶劑，用玻璃棒攪拌勻。萃取一段時(shí)間吸取上清液于分液漏斗中，用蒸餾水重復(fù)沖洗3次，量取上清液總體積后再吸取0.5mL于小燒杯。置水浴鍋60下?lián)]干。殘?jiān)尤? mL甲醇溶液和2 mL硫磷鐵顯色劑。加硫磷顯色劑時(shí)，要沿壁慢慢加入，等其與甲醇分層后，立即搖勻，以便產(chǎn)生足夠熱量(80)使顯色完全。冷卻至

22、室溫后，以溶劑代替蛋黃稀釋液作空白，用分光光度計(jì)在550 rim波長下比色14。按照以下公式計(jì)算膽固醇含量：蛋黃中膽固醇含量(mg/100g)= (c42v25100) /(w1000)式中，C為提取液中膽固醇的濃度(ugmL)，V為提取液體積(mL)，W為蛋黃勻液質(zhì)量(g)。繪制膽固醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，本文選擇的條件是在顯色后3040min內(nèi)，于波長550nm處15測定光密度。為了找到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間、合適的波長，作了兩組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)如下：吸取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)使用液2.0ml于25ml具塞比色管中，在管中加入冰醋酸6ml，硫磷鐵顯色劑4ml，立即搖勻顯色。一組實(shí)驗(yàn)是在顯色后3040min內(nèi)，于不同的波長處測

23、定其光密度；另一組實(shí)驗(yàn)是在顯色后，于550nm波長處，在不同的時(shí)間測定其光密度，可以看出，膽固醇在波長550nm處有最大吸收。當(dāng)在波長550nm處測定光密度時(shí)，剛開始的8l3min光密度變化較大，這是因?yàn)榇藭r(shí)溶液極不穩(wěn)定，而在3040min內(nèi)，溶液較為穩(wěn)定。因此，選擇了顯色后3040min內(nèi)，于波長550nm處測定光密度。經(jīng)典的方法操作過程繁雜，特別是樣品的前處理和樣品中脂肪的提取，持續(xù)時(shí)間長，所需試劑多，造成了比色結(jié)果的偏差和計(jì)算結(jié)果的復(fù)雜化，且成本高，所以選擇了蛋黃中膽固醇含量的快速測定方法進(jìn)行測定。用該法測定不需提取蛋黃樣品中的脂質(zhì)，用直接皂化法即可。這樣不僅避免用毒性大而昂貴的試劑，且

24、操作時(shí)間大大縮短。1.2.2高效液相色譜法測禽蛋中膽固醇含量取雞蛋稱重，去除蛋清，稱取蛋黃總質(zhì)量，計(jì)算蛋黃相對質(zhì)量。取蛋黃6g，精密稱定，置于10ml量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，混勻，得蛋黃稀釋液。精密量取蛋黃稀釋液1ml于5ml離心管中，加入含2.0mol/ml KOH的乙醇溶液1.0ml，震蕩混勻，置于55水浴中皂化30min（每隔5min震搖1次）后取出，經(jīng)流水冷卻，加入正乙烷：異丙烷（4:1）2.0ml，混勻后3000r/min離心3min，吸取上清液于蒸發(fā)皿中，重復(fù)萃取4次，揮發(fā)干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?ml，用0.45微升微孔濾膜，取續(xù)濾液，既得供試品溶液。色譜條件：色譜柱：Di

25、nkma Diamonil TM(鉆石)-C18（5m，250mm4.6mm）；流動相：100%甲醇，流速：1ml/min，柱溫：25；蒸發(fā)散射檢測器：氮?dú)饬魉贋?L/min，漂移管溫度為8516。進(jìn)樣測膽固醇含量。1.2.3酶法測定禽蛋中膽固醇含量雞蛋膽固醇提取全蛋膽固醇提取:將蛋打入燒杯中直至蛋殼不滴蛋清為止，用攪拌機(jī)打成勻漿(1500r/min，2min)，稱取100500mg放入10mL帶蓋塑料離心管底部，于旋渦混合器上高速旋渦振蕩下徐徐加入5000l乙醇，使蛋白分散成細(xì)小的沉淀，加蓋再旋渦振蕩1min，室溫下放10min，10000r/min離心10min，留上清液供測試17。蛋黃膽

26、固醇提取:將蛋打入培養(yǎng)皿中，用鑷子將包裹在蛋黃上的蛋清小心剝離，然后用礦泉水瓶吸取蛋黃至吸水紙上，吸去黏附蛋清，將蛋黃轉(zhuǎn)移于燒杯中，用攪拌機(jī)打成勻漿(1500r/min，2min)，稱取150250mg蛋黃液，然后如上操作，留上清液供測試。總膽固醇含量測定原理及測定方法：在自然界中，膽固醇以游離膽固醇和膽固醇酯兩種形式存在。酯化的膽固醇經(jīng)膽固醇酯酶水解后，經(jīng)膽固醇氧化酶氧化生成膽甾-4-烯-3-酮，所產(chǎn)生的過氧化氫在過氧化物酶催化下與4-AAP和DHBS反應(yīng)生成紅色的醌亞胺類化合物，醌亞胺在500nm有特異吸收峰，反應(yīng)產(chǎn)生的顏色與總膽固醇含量成正比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋黃膽固醇含量。膽固醇酯+H

27、2O(膽固醇酯酶)膽固醇+脂肪酸 膽固醇+O2(膽固醇氧化酶)膽甾-4-烯-3-酮+H2O2 H2O2+4-氨基安替比林+DHBS(過氧化物酶)醌亞胺色原+H2O測定方法:取200uL上清液于1cm比色杯底部，將2000uL測定試劑快速注入比色杯底部，用封口膜封口，隨即反復(fù)顛倒10次，37保溫10min，于500nm測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品膽固醇含量。1.2.4方法比較目前測定蛋黃中膽固醇含量所采用的比色法和高效液相色譜法也有用酶法，多需對樣品進(jìn)行皂化處理和多次提取，以消除蛋黃中其他共存脂質(zhì)成分的干擾，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，通常需要數(shù)小時(shí)甚至13d完成一個(gè)樣品的測定，不適用于大批量樣品的快速檢

28、測。將比色法改進(jìn)后處理樣品所需時(shí)間較少，操作簡單，所需儀器設(shè)備也很常見，適合一般實(shí)驗(yàn)室操作，因此在這里我選擇直接皂化比色法測定雞胚孵化過程中膽固醇的含量變化。此實(shí)驗(yàn)方法不僅節(jié)儉時(shí)間，而且還很簡潔。1.3禽胚孵化過程中膽固醇含量變化的研究雞胚在長發(fā)育過程吸收利用了雞蛋中的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行了一系列的生物轉(zhuǎn)化，其化學(xué)成分、營養(yǎng)價(jià)值發(fā)生了很大變化，營養(yǎng)價(jià)值較雞蛋的要高。例如VE 含量比雞蛋增加100倍，?；撬嵩黾?1倍，蛋白質(zhì)、非蛋白氮、灰分、角化蛋白、鈣磷的含量均有增加、其它元素如鐵、鉀、鈉、鎂、銅、錳等含量也有提高，而且存在形式發(fā)生了有利的變化，使其容易被人體吸收，這對于促進(jìn)兒童生長發(fā)育，防止老年人

29、骨質(zhì)疏松都有特殊功效，也是產(chǎn)婦補(bǔ)鈣補(bǔ)鐵的好食品18。李國喜碩士的研究表明，固始雞蛋在入孵前膽固醇含量為25.49mg/g，3胚齡和6胚齡含量明顯升高，尤以36胚齡增幅最大，6胚齡時(shí)每克蛋黃干物質(zhì)膽固醇含量比入孵前增加了14.08%。9胚齡含量明顯低于6胚齡，此期含量相當(dāng)于入孵前的74.07%。以后，膽固醇含量逐漸降低，到21胚齡出殼時(shí)降至4.61mg/g，相當(dāng)于入孵前的18.09%。從入孵到出殼(021胚齡)，每克蛋黃膽固醇含量減少了20.88mg/g，是入孵前含量的81.91%。整個(gè)孵化期膽固醇含量變化呈“升降升降”的態(tài)勢。06胚齡含量明顯升高，到6胚齡達(dá)孵化期間最高水平。69胚齡膽固醇含量

30、急劇降低，相對變化量為35.08%，平均降低10.2mg/g，是整個(gè)孵化期降幅的48.85%。1215胚齡相對變化量出現(xiàn)負(fù)增長；1521胚齡相對變化量最大，為57.69%，膽固醇含量降了8.65mg/g，是全孵化期降幅的36.64%19。從降低膽固醇攝入量角度考慮，從6胚齡開始蛋黃膽固醇含量是一直下降的，雞胚蛋在孵化初期變化較小，在孵化10天時(shí)有明顯增加和減小，至19天相對穩(wěn)定。因此從營養(yǎng)和功效方面考慮，孵化1019天都可以認(rèn)為是最佳的食用期。第2章 材料與方法第2章 材料與方法2.1材料2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器VIS-7220型可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；AL204電子天平，梅特勒-托利

31、多儀器（上海）有限公司；恒溫水浴箱，上海安亭科學(xué)儀器廠。 2.1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑膽固醇原液：稱取干燥恒重結(jié)晶膽固醇100mg，用甲醇溶解后移入100mL容量瓶定容貯存于密閉棕色瓶內(nèi)置于4冰箱保存；鐵貯存液：稱取三氯化鐵2.5g，溶于87濃磷酸鈉并定容至100 mL，貯存于密閉棕色瓶，常溫下保存；硫磷鐵顯色劑：吸取貯存液8 mL。加濃硫酸至刻度100 mL；10氫氧化鉀溶液：稱取10 g氫氧化鉀先溶解再定容至100 mL；無水乙醇、石油醚、甲醇等；以上試劑均為分析純。2.1.3雞胚蛋本次試驗(yàn)采用的是海蘭褐蛋雞胚，分別取0、3、6、9、12、15胚齡的正常存活的雞胚蛋。雞胚蛋購自新安縣第一種雞場

32、孵化場。2.2方法2.2.1雞蛋膽固醇的提取和測定膽固醇主要存在于蛋黃內(nèi)，測定時(shí)應(yīng)直接吸取蛋黃進(jìn)行測定，考慮到使用的是冷凍的禽胚，在使用前蛋黃和蛋清已經(jīng)混在一起，而且到達(dá)一定胚齡后，禽蛋內(nèi)已經(jīng)形成肉胎，不能直接進(jìn)行上述操作，所以使用攪拌機(jī)將樣品進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，打碎，然后按上述操作進(jìn)行處理，并使用9000r/min離心機(jī)離心，取上層液作為試驗(yàn)用溶液。準(zhǔn)確稱取3 g雞胚勻液。置于25 mL比色管內(nèi)，加蒸餾水溶解并定容至刻度搖勻。得到雞胚稀釋液。準(zhǔn)確吸取1 mL雞胚稀釋液于50mL燒杯中，加入3 mL 10氫氧化鉀溶液及10 mL無水乙醇溶液攪勻，在60水浴直接皂化1 h(每隔15 min攪拌1次)后

33、取出，冷卻后置于一定溫度下水浴。加入一定量石油醚溶劑，用玻璃棒攪拌勻。萃取一段時(shí)間吸取上清液于分液漏斗中，用蒸餾水重復(fù)沖洗3次，量取上清液總體積后再吸取0.5 mL于小燒杯。置水浴鍋60下?lián)]干殘?jiān)尤? mL甲醇溶液和2 mL硫磷鐵顯色劑。加硫磷顯色劑時(shí)，要沿壁慢慢加入，等其與甲醇分層后，立即搖勻，以便產(chǎn)生足夠熱量(80)使顯色完全。冷卻至室溫后，以溶劑代替蛋黃稀釋液作空白，用分光光度計(jì)在550 nm波長下比色。按照以下公式計(jì)算膽固醇含量：蛋黃中膽同醇含量(mg/100g)= (c42v25100) /(w1000)式中，C為提取液中膽固醇的濃度(ug/mL)，V為提取液體積(mL)，W為蛋黃

34、勻液質(zhì)量(g)。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品5mg，置于25ml容量瓶中，用色譜純異丙醇并定容，得膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液（200ug/ml）。取濃度為1 mg/mL的膽同醇原液20。在臨用時(shí)用甲醇稀釋成0.04 mg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)母液。吸取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)母液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL(相當(dāng)于膽固醇0、16、32、48、64、80仙g)分別移入25 mL比色管，用甲醇定容至2 mL，再沿管壁緩慢加入2 mL硫磷鐵顯色劑，迅速搖勻，冷卻至室溫后，以甲醇作空白用分光光度計(jì)在550nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖1，標(biāo)準(zhǔn)液膽固醇濃度在020 ug/mL的范圍時(shí)符合郎

35、伯比爾定律，線性回歸方程為y=0.0286x-0.0071，R2=0.9991。圖1膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1Cholesterolstandard curve2.2.3精密度和重復(fù)性試驗(yàn)(1)精密度試驗(yàn)。隨機(jī)取同一品種12個(gè)雞蛋，除蛋清，取蛋黃液勻漿，按照上邊已做過的試驗(yàn)流程，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，每隔5 rain在分光光度計(jì)下測1次，定量測定膽固醇含量，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察試驗(yàn)的精密度。(2)重復(fù)性試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取6份雞蛋黃漿樣，按照上邊已做過的方法提取膽同醇，分別測定各提取液吸光度A550，定量測定膽同醇含量，計(jì)算RSD，考察試驗(yàn)的重復(fù)性。2.2.4回收率試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取已測定膽固醇含

36、量的蛋黃液0.15 g，共5份，各加入2.5 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)原液。按1.2.1方法測定膽固醇含量，計(jì)算回收率及RSD。評價(jià)試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度。18第3章 結(jié)果與分析第3章 結(jié)果與分析3.1實(shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)確性矯正電子天平進(jìn)行矯正，存在0.0003g誤差，即稱得的物品比實(shí)際重量少0.0003g，因此在稱量標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，取膽固醇樣品0.0053g。移液槍矯正，取一毫升移液管，準(zhǔn)確量取1ml水，再用移液槍取1ml水，比較兩次取液量相同。3.2波長的選擇吸取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，操作同試驗(yàn)方法。然后在不同的波長下(460640 am)以甲醇溶液和硫磷鐵顯色劑作空白進(jìn)行測定各吸光度，結(jié)果見表l，膽固醇在550 n

37、m處有最大吸光度，所以本試驗(yàn)選用550 nm的波長。表1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同波長下的吸光度Tabe1 cholesterol standard solution absorbance at different wavelengths波長吸光度波長吸光度4600.3755600.5244800.4145800.4125000.4546000.3505200.4626200.2755400.4896400.2475500.5683.3顯色劑用量試驗(yàn)在同一試驗(yàn)條件下，顯色劑用量為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL時(shí)，吸光義分別為0.236、0.360、0.524、0.507、0.5

38、16、0.499?？梢?，顯色劑用量在23.5mL范圍內(nèi)測定結(jié)果變化不大。取2.0 mL為最佳。因此本試驗(yàn)選擇顯色劑用量取2.0 mL。3.4雞蛋孵化期間膽固醇含量的變化本實(shí)驗(yàn)采用比色法對不同日齡的海蘭褐蛋雞雞胚孵化過程中膽固醇含量進(jìn)行測定。結(jié)果見下圖：整個(gè)孵化期膽固醇含量不斷下降，變化率呈由慢到快再到慢的趨勢21；0d6d胚齡膽固醇含量變化較小，相對變化量為7.769%；6d15d胚齡膽固醇含量急劇降低，相對變化59.7%；其中，中期(6d9d)相對變化量為31.23%，后期(9d15d)胚齡相對變化量為44.51%。表2雞蛋孵化期間各個(gè)胚齡膽固醇含量Tabe2 Egg hatching pe

39、riod each embryo age cholesterol content胚齡（d）膽固醇量（mg/100g）0812.433785.466749.319515.2712478.7615302.13圖2雞蛋孵化過程中膽固醇含量的變化Figure2 Changes of cholesterol content of egg during incubation3.5膽固醇穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將膽固醇提取液在自然光條件下，每隔15 min測定1次溶液吸光度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，提取液中膽同醇的吸光度在0.25 h內(nèi)隨測定時(shí)間逐漸變小。2 h內(nèi)吸光度變化較小，但2 h后吸光度開始明顯下降。因此，加入顯

40、色劑冷卻至室溫后的2 h內(nèi)必須比色完畢。圖3顯色時(shí)間對膽固醇測定的影響Figure 3Effects of chromogenic time on cholesterol determination3.6加標(biāo)回收率測定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取已測定膽固醇含量的蛋黃液5份(每100 g雞蛋黃膽同醇含量為1648mg)進(jìn)行回收試驗(yàn)，測得平均回收率為95.41，RSD為3.77，方法準(zhǔn)確度較好(表3)。表3 加標(biāo)回收率測定Tabe3 Determination of standard addition recovery rate稱樣量(g)樣品中膽固醇含量(mg)標(biāo)準(zhǔn)品加入量(mg)測得總含量(mg)回收率(%

41、)平均回收率(%)RSD(%)0.15302.4772.505.0296.6895.413.770.15052.4802.504.94101.220.15022.4752.504.8291.860.15122.4922.504.9092.520.15082.4852.504.8594.753.7實(shí)驗(yàn)誤差在稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品在使用前，即便沒有打開過，但是可能含有一定量的水分，因此，在使用前低溫干燥1小時(shí)，除去水分，除水時(shí)間稍短，可能沒有將水分處理干凈。另外，根據(jù)“HPLC-ELSD測定雞蛋中膽固醇的含量”的研究結(jié)果，膽固醇在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，但是在測定樣品時(shí)，從處理樣品到樣品被檢測，經(jīng)過時(shí)間超過12

42、小時(shí)，可能造成部分當(dāng)固醇分解，造成膽固醇含量損失，使得測定的膽固醇比原來禽蛋中的含量要低22。當(dāng)然考慮到這點(diǎn)原因，在處理樣品時(shí)，我選擇在夜晚進(jìn)行，并且盡量在燈光強(qiáng)度較暗的地方進(jìn)行操作，一方面使得樣品避免過多的光線的刺激，另一方面，晚上處理樣品，第二天直接測定，盡量減少縮短整個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，縮短樣品處理和檢測之間的間隔時(shí)間，盡量在樣品相對穩(wěn)定的情況下進(jìn)行測定。另外，因?yàn)槟懝檀紭?biāo)準(zhǔn)品為粉狀物質(zhì)，考慮到這樣的性狀，有可能被強(qiáng)風(fēng)吹飛，因此在使用40水浴氮?dú)獯蹈蓵r(shí)，選擇氮?dú)饬魉傧鄬^低，盡量保證在吹干的時(shí)候保證樣品中提取出來的膽固醇能過完全留在容器內(nèi)，能夠溶解所有提取出來的膽固醇，同時(shí)在低流速的氮?dú)馔ㄈ霑r(shí)

43、，保證樣品盡量少接觸氧氣，使得膽固醇不被空氣中的氧氣氧化。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，不可避免的會有一些人為操作誤差，我在試驗(yàn)過程中盡量嚴(yán)格按照操作規(guī)程以及實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)，但是有些誤差仍會不可避免。因此，實(shí)驗(yàn)過程中我嚴(yán)格遵守試驗(yàn)操作規(guī)范及流程，提升試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。第4章 結(jié)論第4章 結(jié)論利用直接皂化比色法測定雞胚孵化過程中膽固醇含量相對于其它方法，操作要更為簡便，也更節(jié)省時(shí)間。使用此方法取樣量少、直接皂化就可以測定、操作程序簡單、儀器要求不高、精密度和準(zhǔn)確度都比較高，是一種測定雞蛋膽固醇含量可行、有效、快速的測定方法。在禽蛋孵化過程中，膽固醇含量在06胚齡降低較慢，而在615胚齡有較大程度的下降。因?yàn)槟懝檀际羌?xì)胞膜的類脂層的主要組成部分，且膽固醇還是合成膽汁酸、維生素D3和類固醇激素的重要材料。這是因?yàn)樵谇莸胺趸^程中需要消耗大量的膽固醇，而在孵化初期，各種生命活動較弱，膽固