乙型肝炎病毒核心區(qū)基因免疫小鼠細胞免疫應答研究

1、    乙型肝炎病毒核心區(qū)基因免疫小鼠細胞免疫應答研究鄧濤武珊珊陳天寶姚鵬張曉紅陳乃玲賈克明 【摘要】目的觀察小鼠對HBV核心區(qū)基因疫苗的免疫應答。方法將經過基因修飾的乙型肝炎病毒核心區(qū)基因定向克隆于真核表達載體(pcDNA3)，構建成HBV核心區(qū)基因疫苗(pcDNA-HBV)，給Balb/c小鼠多點肌肉注射，2周后追加免疫一次，用競爭抑制酶聯(lián)法及MTT法檢測小鼠血清抗-HBc及脾細胞對HBcAg的特異性增殖反應。結果免疫接種2周后小鼠血清抗-HBc均陽性，持續(xù)12周以上，脾細胞對HBcAg的刺激指數(shù)明顯高于對照組(P0.05)。結論pcDNA-HBV在

2、Balb/c小鼠體內既可誘導體液免疫應答，又可誘導特異性的細胞免疫應答。 【關鍵詞】肝炎病毒，乙型基因，免疫應答 The immune response in Balb/c mice immunized with hepatitis B virus core DNA-based vaccineDeng Tao,Wu Shanshan,Cheng Tianbao,et al.Institute of Liver Diseases,PLA,Beijing 100700 【Abstract】ObjectiveTo study immune response in mice against the H

3、BV core DNA-based vaccine.MethodsThe modificated HBc gene with its stem and loopstructure was inserted into the eukaryotic expression vector (pcDNA-HBV).The Balb/c mice were immunized by multiple sites intramuscular injection with pcDNA-HBV and pcDNA3 respectively.Each mouse was boosted after 2 week

4、s.The anti-HBc Ab was detected by ELISA,meanwhile,the stimulation index of spleencytes to HBcAg were measured by MTT method.ResultsThe anti-HBc in mice immunized with pcDNA-HBV became and maintained to be positive for at least 12 weeks.The stimulation index of spleencytes to HBcAg were significantly

5、 higher than that of mice injected with pcDNA3.ConclusionThe investigation demonstrated that pcDNA-HBV could generated humoral and cellular immune response in Balb/c mice. 【Key words】Hepatitis B VirusGene,immune response 慢性乙型病毒性肝炎患者HBV難以清除的重要原因之一是機體細胞免疫功能障礙，尤其是針對HBV主要靶抗原即核心抗原(HBcAg)的特異性細胞毒T細胞(CTL)功能

6、低下1?；蛎庖呤墙鼛啄臧l(fā)展起來的新的生物技術，不僅可誘導體液免疫應答，而且可誘導強烈而持久的細胞免疫應答。這種特異性的細胞免疫應答不僅對預防不同株型的病毒感染具有重要意義，而且對慢性病毒感染具有治療作用25。為了探求慢性乙型肝炎(乙肝)防治新策略，我們在原實驗基礎上對HBV核心區(qū)基因疫苗的細胞免疫應答進行了實驗研究。 材料和方法 一、pcDNA-HBV的構建及鑒定 從含HBV(ayw型)核心基因片斷的原核表達質粒pUC19(中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所詹美云教授贈)經BamHI及Hind雙酶切，電泳回收其中1kb的含有ATG和TAG的核心基因片段，定向克隆于已預先用Hind和BamHI雙酶消

7、化好的真核表達載體pcDNA3的CMV啟動子下游，稱之為pcDNA-HBV。經Hind和BamHI雙酶切電泳分析鑒定，并通過PCR檢測構建的pcDNA-HBV中有無HBV核心區(qū)基因片斷，PCR試劑盒購自美國Biogene公司。 二、pcDNA-HBV大量制備 pcDNA-HBV質粒轉化工程菌JM109，篩選陽性克隆，經LB培養(yǎng)基擴增，按堿裂解方法提取質粒，通過紫外分光光度計測定其濃度，按1g/l溶于無菌PBS，-20儲存?zhèn)溆谩?三、基因免疫接種 選用46周齡的Balb/c小鼠，用1ml的OT注射器(25號針頭)行雙后肢多點肌肉注射，每只總量100g，2周后追加免疫一次。實驗中分別設實驗組(注射

8、pcDNA-HBV、n=5)及對照組(注射空載pcDNA3、n=4)組。 四、T細胞抗原特異性增殖反應測定 免疫4周后，制備小鼠脾細胞懸液，細胞濃度為1×106/ml，加入96孔板，每孔100l，平行三孔，分別加入HBcAg5g/孔及1300植物血凝素(PHA)，37、5%CO2，溫育72小時，加四甲基偶氮唑鹽(MTT)10l，37、6小時，加鹽酸異丙醇100l，混勻，靜置15分鐘，測各孔A570值，計算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=實驗組A值/對照組A值。 五、血清抗體檢測 采用競爭抑制酶聯(lián)免疫試驗動態(tài)觀測小鼠血清抗-HBc變化，試劑盒購自珠海亞利公司，按試劑盒說明檢測，抑制率50%為陽性，

9、50%為陰性。 結果 一、pcDNA-HBV的構建及鑒定 真核表達載體pcDNA3帶有巨細胞病毒啟動子(PCMV)和poly A序列，可保證插入基因用自身起始密碼在多種哺乳動物細胞內高效表達。插入的HBc基因已通過基因修飾，將位于核心基因起始信號上游障礙其表達的環(huán)莖狀結構(約30bp)剪切掉，再化學合成一段包含起始信號的人工接頭與其拼接，繼而被定向克隆于pcDNA3 CMV啟動子的下游，稱其為pcDNA3 HBV。將pcDNA HBV用Hind和BamHI雙酶切，可獲得5.4kb及1kb兩條帶，而pcDNA3雙酶切分析僅見5.4kb的一條帶，證明1kb的HBc基因已被插入。為進一步證明其特異性

10、，將pcDNA3 HBV通過PCR檢測HBV核心區(qū)基因，結果顯示可獲得一510bp的HBc條帶，而空載pcDNA則無此條帶，pcDNA HBV結構圖及鑒定見文獻6。 二、T細胞抗原特異性增殖反應結果 附表小鼠脾細胞對HBcAg的增殖反應指數(shù) 組別 只數(shù) HBcAg HBcAg+PHA pcDNA-HBV 5 1.532 1.651 pcDNA對照組 5 0.991 1.181 P值 0.05 0.05 三、小鼠血清抗-HBc-IgG檢測結果 追加免疫1周后基因免疫組(n=5)均出現(xiàn)了抗-HBc抗體，其抑制率的動態(tài)改變見圖1，而空載質粒pcDNA3對照組(n=5)及未經免疫的正常鼠(n=5)血清

11、抗-HBc抗體均陰性。 No.1,No.2,No.3,No.4,No.5為免疫鼠編號，Normal為對照組 圖1小鼠血清抗-HBc抗體動態(tài)水平 討論 許多實驗證明慢性乙肝患者HBV難以清除的重要原因之一是機體細胞免疫功能低下，尤其是針對HBV主要靶抗原(HBcAg)的特異性細胞毒性T細胞功能低下?；蛎庖呒瓤烧T導機體體液免疫應答，又可誘導機體細胞免疫應答，這種特異性的細胞免疫應答不僅對預防不同株型的病毒感染具有重要作用，而且對慢性病毒感染具有治療作用。Tokushige、Wang等4，7已分別進行了HCV、HIV核心區(qū)基因免疫實驗研究，并在小鼠體內獲得了特異性的細胞及體液免疫應答。為了探求慢性

12、乙肝新的免疫治療措施，此前作者已構建了HBV核心區(qū)基因疫苗，并在Balb/c小鼠體內獲得了體液免疫應答，本實驗在此基礎上進行了細胞免疫應答研究。結果顯示pcDNA-HBV免疫組小鼠脾細胞對HBcAg的增殖反應指數(shù)明顯高于對照組，提示pcDNA-HBV在Balb/c小鼠體內既可誘導體液免疫應答，又可誘導特異性的細胞免疫應答，與Kuhber研究結果類似。而且，Kuhber等8還研究發(fā)現(xiàn)單用HBcAg不能誘導細胞免疫應答，而用表達HBcAg的質粒免疫小鼠則可獲得MHCI限制的特異性的CTL應答，并認為這種特異性的CTL應答對慢性病毒感染具有治療作用，是一種新的有希望的免疫治療策略。 基因免疫的抗原加

13、工及呈遞過程可能存在以下三種途徑：(1) 肌纖維細胞被質粒DNA轉染，表達的抗原蛋白在肌纖維細胞內被加工后形成小分子抗原多肽，繼而與肌纖維細胞內的MHC-I分子結合，激活T淋巴細胞。肌纖維豐富而獨特的T小管系統(tǒng)有助于質粒DNA的吸收；(2) 肌肉組織中的抗原呈遞細胞如樹突狀細胞(dendritic cells)在免疫接種過程中可能被質粒DNA轉染而進行抗原呈遞；(3) 抗原蛋白從肌細胞分泌出來后，被樹突狀細胞吞噬處理，然后與MHC-分子結合，激活T細胞、B細胞，進而誘導機體細胞及體液免疫應答，但HBcAg不能從細胞內分泌至細胞外，這可能是HBV核心區(qū)基因免疫體液免疫應答較弱的原因之一2，3。

14、本課題受國家自然科學基金資助(39770660) 作者單位：100700北京軍區(qū)總醫(yī)院解放軍肝病研究所 參考文獻 1Lohr H,Weber W.Schlaak J,et al.Proliferative response of CD4+T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68. 2鄧濤，陳乃玲，賈克明.病毒核酸疫苗的研究現(xiàn)狀.國外醫(yī)學病毒學分

15、冊，1996，3：88-92. 3Michel ML,Davis H,Schleef M,et al.DNA-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice:Aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans.Pro Natl Acad Sci USA,1995,92:5307-5311. 4Tokushige K,Wakita T,Pachul C,et al.Expression and immune resp

16、onse to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs.Hepatology,1996,24:14-20. 5Davis HL,Schirmbeck R,Reimann J,et al.DNA-mediated immunization in mice induces a potent MHC class I-restricted cytotoxic T lympho-cyte response to the hepatitis B envelope protein.Human Gene Therapy,1995,6:1447-1456. 6鄧濤，陳乃玲，陳天寶，等.乙肝病毒核心區(qū)基因免疫小鼠初步研究.中國公共衛(wèi)生學報，1998，17：13-14. 7Wang B,Ugen KE,Srickantan V,et al.Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficien