乙型肝炎病毒核心區(qū)基因免疫小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答研究

1、    乙型肝炎病毒核心區(qū)基因免疫小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答研究鄧濤武珊珊陳天寶姚鵬張曉紅陳乃玲賈克明 【摘要】目的觀察小鼠對(duì)HBV核心區(qū)基因疫苗的免疫應(yīng)答。方法將經(jīng)過基因修飾的乙型肝炎病毒核心區(qū)基因定向克隆于真核表達(dá)載體(pcDNA3)，構(gòu)建成HBV核心區(qū)基因疫苗(pcDNA-HBV)，給Balb/c小鼠多點(diǎn)肌肉注射，2周后追加免疫一次，用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)法及MTT法檢測(cè)小鼠血清抗-HBc及脾細(xì)胞對(duì)HBcAg的特異性增殖反應(yīng)。結(jié)果免疫接種2周后小鼠血清抗-HBc均陽性，持續(xù)12周以上，脾細(xì)胞對(duì)HBcAg的刺激指數(shù)明顯高于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論pcDNA-HBV在

2、Balb/c小鼠體內(nèi)既可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，又可誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 【關(guān)鍵詞】肝炎病毒，乙型基因，免疫應(yīng)答 The immune response in Balb/c mice immunized with hepatitis B virus core DNA-based vaccineDeng Tao,Wu Shanshan,Cheng Tianbao,et al.Institute of Liver Diseases,PLA,Beijing 100700 【Abstract】ObjectiveTo study immune response in mice against the H

3、BV core DNA-based vaccine.MethodsThe modificated HBc gene with its stem and loopstructure was inserted into the eukaryotic expression vector (pcDNA-HBV).The Balb/c mice were immunized by multiple sites intramuscular injection with pcDNA-HBV and pcDNA3 respectively.Each mouse was boosted after 2 week

4、s.The anti-HBc Ab was detected by ELISA,meanwhile,the stimulation index of spleencytes to HBcAg were measured by MTT method.ResultsThe anti-HBc in mice immunized with pcDNA-HBV became and maintained to be positive for at least 12 weeks.The stimulation index of spleencytes to HBcAg were significantly

5、 higher than that of mice injected with pcDNA3.ConclusionThe investigation demonstrated that pcDNA-HBV could generated humoral and cellular immune response in Balb/c mice. 【Key words】Hepatitis B VirusGene,immune response 慢性乙型病毒性肝炎患者HBV難以清除的重要原因之一是機(jī)體細(xì)胞免疫功能障礙，尤其是針對(duì)HBV主要靶抗原即核心抗原(HBcAg)的特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)功能

6、低下1?；蛎庖呤墙鼛啄臧l(fā)展起來的新的生物技術(shù)，不僅可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，而且可誘導(dǎo)強(qiáng)烈而持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。這種特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答不僅對(duì)預(yù)防不同株型的病毒感染具有重要意義，而且對(duì)慢性病毒感染具有治療作用25。為了探求慢性乙型肝炎(乙肝)防治新策略，我們?cè)谠瓕?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)HBV核心區(qū)基因疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。 材料和方法 一、pcDNA-HBV的構(gòu)建及鑒定 從含HBV(ayw型)核心基因片斷的原核表達(dá)質(zhì)粒pUC19(中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所詹美云教授贈(zèng))經(jīng)BamHI及Hind雙酶切，電泳回收其中1kb的含有ATG和TAG的核心基因片段，定向克隆于已預(yù)先用Hind和BamHI雙酶消

7、化好的真核表達(dá)載體pcDNA3的CMV啟動(dòng)子下游，稱之為pcDNA-HBV。經(jīng)Hind和BamHI雙酶切電泳分析鑒定，并通過PCR檢測(cè)構(gòu)建的pcDNA-HBV中有無HBV核心區(qū)基因片斷，PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biogene公司。 二、pcDNA-HBV大量制備 pcDNA-HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌JM109，篩選陽性克隆，經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，按堿裂解方法提取質(zhì)粒，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，按1g/l溶于無菌PBS，-20儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?三、基因免疫接種 選用46周齡的Balb/c小鼠，用1ml的OT注射器(25號(hào)針頭)行雙后肢多點(diǎn)肌肉注射，每只總量100g，2周后追加免疫一次。實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組(注射

8、pcDNA-HBV、n=5)及對(duì)照組(注射空載pcDNA3、n=4)組。 四、T細(xì)胞抗原特異性增殖反應(yīng)測(cè)定 免疫4周后，制備小鼠脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入96孔板，每孔100l，平行三孔，分別加入HBcAg5g/孔及1300植物血凝素(PHA)，37、5%CO2，溫育72小時(shí)，加四甲基偶氮唑鹽(MTT)10l，37、6小時(shí)，加鹽酸異丙醇100l，混勻，靜置15分鐘，測(cè)各孔A570值，計(jì)算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值。 五、血清抗體檢測(cè) 采用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫試驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀測(cè)小鼠血清抗-HBc變化，試劑盒購(gòu)自珠海亞利公司，按試劑盒說明檢測(cè)，抑制率50%為陽性，

9、50%為陰性。 結(jié)果 一、pcDNA-HBV的構(gòu)建及鑒定 真核表達(dá)載體pcDNA3帶有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(PCMV)和poly A序列，可保證插入基因用自身起始密碼在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。插入的HBc基因已通過基因修飾，將位于核心基因起始信號(hào)上游障礙其表達(dá)的環(huán)莖狀結(jié)構(gòu)(約30bp)剪切掉，再化學(xué)合成一段包含起始信號(hào)的人工接頭與其拼接，繼而被定向克隆于pcDNA3 CMV啟動(dòng)子的下游，稱其為pcDNA3 HBV。將pcDNA HBV用Hind和BamHI雙酶切，可獲得5.4kb及1kb兩條帶，而pcDNA3雙酶切分析僅見5.4kb的一條帶，證明1kb的HBc基因已被插入。為進(jìn)一步證明其特異性

10、，將pcDNA3 HBV通過PCR檢測(cè)HBV核心區(qū)基因，結(jié)果顯示可獲得一510bp的HBc條帶，而空載pcDNA則無此條帶，pcDNA HBV結(jié)構(gòu)圖及鑒定見文獻(xiàn)6。 二、T細(xì)胞抗原特異性增殖反應(yīng)結(jié)果 附表小鼠脾細(xì)胞對(duì)HBcAg的增殖反應(yīng)指數(shù) 組別 只數(shù) HBcAg HBcAg+PHA pcDNA-HBV 5 1.532 1.651 pcDNA對(duì)照組 5 0.991 1.181 P值 0.05 0.05 三、小鼠血清抗-HBc-IgG檢測(cè)結(jié)果 追加免疫1周后基因免疫組(n=5)均出現(xiàn)了抗-HBc抗體，其抑制率的動(dòng)態(tài)改變見圖1，而空載質(zhì)粒pcDNA3對(duì)照組(n=5)及未經(jīng)免疫的正常鼠(n=5)血清

11、抗-HBc抗體均陰性。 No.1,No.2,No.3,No.4,No.5為免疫鼠編號(hào)，Normal為對(duì)照組 圖1小鼠血清抗-HBc抗體動(dòng)態(tài)水平 討論 許多實(shí)驗(yàn)證明慢性乙肝患者HBV難以清除的重要原因之一是機(jī)體細(xì)胞免疫功能低下，尤其是針對(duì)HBV主要靶抗原(HBcAg)的特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能低下?；蛎庖呒瓤烧T導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答，又可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答，這種特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答不僅對(duì)預(yù)防不同株型的病毒感染具有重要作用，而且對(duì)慢性病毒感染具有治療作用。Tokushige、Wang等4，7已分別進(jìn)行了HCV、HIV核心區(qū)基因免疫實(shí)驗(yàn)研究，并在小鼠體內(nèi)獲得了特異性的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答。為了探求慢性

12、乙肝新的免疫治療措施，此前作者已構(gòu)建了HBV核心區(qū)基因疫苗，并在Balb/c小鼠體內(nèi)獲得了體液免疫應(yīng)答，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了細(xì)胞免疫應(yīng)答研究。結(jié)果顯示pcDNA-HBV免疫組小鼠脾細(xì)胞對(duì)HBcAg的增殖反應(yīng)指數(shù)明顯高于對(duì)照組，提示pcDNA-HBV在Balb/c小鼠體內(nèi)既可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，又可誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，與Kuhber研究結(jié)果類似。而且，Kuhber等8還研究發(fā)現(xiàn)單用HBcAg不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，而用表達(dá)HBcAg的質(zhì)粒免疫小鼠則可獲得MHCI限制的特異性的CTL應(yīng)答，并認(rèn)為這種特異性的CTL應(yīng)答對(duì)慢性病毒感染具有治療作用，是一種新的有希望的免疫治療策略。 基因免疫的抗原加

13、工及呈遞過程可能存在以下三種途徑：(1) 肌纖維細(xì)胞被質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，表達(dá)的抗原蛋白在肌纖維細(xì)胞內(nèi)被加工后形成小分子抗原多肽，繼而與肌纖維細(xì)胞內(nèi)的MHC-I分子結(jié)合，激活T淋巴細(xì)胞。肌纖維豐富而獨(dú)特的T小管系統(tǒng)有助于質(zhì)粒DNA的吸收；(2) 肌肉組織中的抗原呈遞細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞(dendritic cells)在免疫接種過程中可能被質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染而進(jìn)行抗原呈遞；(3) 抗原蛋白從肌細(xì)胞分泌出來后，被樹突狀細(xì)胞吞噬處理，然后與MHC-分子結(jié)合，激活T細(xì)胞、B細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，但HBcAg不能從細(xì)胞內(nèi)分泌至細(xì)胞外，這可能是HBV核心區(qū)基因免疫體液免疫應(yīng)答較弱的原因之一2，3。

14、本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(39770660) 作者單位：100700北京軍區(qū)總醫(yī)院解放軍肝病研究所 參考文獻(xiàn) 1Lohr H,Weber W.Schlaak J,et al.Proliferative response of CD4+T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68. 2鄧濤，陳乃玲，賈克明.病毒核酸疫苗的研究現(xiàn)狀.國(guó)外醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分

15、冊(cè)，1996，3：88-92. 3Michel ML,Davis H,Schleef M,et al.DNA-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice:Aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans.Pro Natl Acad Sci USA,1995,92:5307-5311. 4Tokushige K,Wakita T,Pachul C,et al.Expression and immune resp

16、onse to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs.Hepatology,1996,24:14-20. 5Davis HL,Schirmbeck R,Reimann J,et al.DNA-mediated immunization in mice induces a potent MHC class I-restricted cytotoxic T lympho-cyte response to the hepatitis B envelope protein.Human Gene Therapy,1995,6:1447-1456. 6鄧濤，陳乃玲，陳天寶，等.乙肝病毒核心區(qū)基因免疫小鼠初步研究.中國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)報(bào)，1998，17：13-14. 7Wang B,Ugen KE,Srickantan V,et al.Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficien