_型鴨肝炎病毒_DHV_在雞胚中的增殖及感染力的測定_圖文

1、0引言鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus ,DHV 是鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis ,DVH 的病原。DVH 是雛鴨的一種急性和高度致死性傳染病,其特征是發(fā)病急,傳播快,病死率高,自然暴發(fā)僅發(fā)生于雛鴨,尤其是13周齡雛鴨,成年鴨具有抵抗力,臨床主要表現(xiàn)為肝臟腫大和出血,該病常給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。鴨肝炎病毒(DHV 有3種血清型,分別為DHV-型、型和型。I 型DHV 最早于1945年由Levine 在美國發(fā)現(xiàn)1,呈世界分布,型分布于英國,型分布局限于美國2-3。中國主要流行的是型鴨病毒性肝炎4,也偶有型DHV 發(fā)現(xiàn)的報(bào)道5。近年,國內(nèi)外相繼報(bào)道

2、了DHV-型的變異株6-8,與型、型鴨肝炎病毒無血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的DHV-型的變異株被稱為新型鴨肝炎病毒(NDHV。I 型DHV 屬于小RNA 病毒科(Picomaviridae 腸型鴨肝炎病毒(DHV-在雞胚中的增殖及感染力的測定馬雙羽1,丁毅1,2,文力正2,袁寶2,任文陟2(1吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,長春,130062;2吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,長春,130062摘要:為確定所分離型鴨肝炎病毒(DHV-毒力,為DHV 單克隆抗體研究做好前期準(zhǔn)備。將型鴨肝炎病毒接種于9日齡SPF 雞胚尿囊腔(0.2mL/胚進(jìn)行增殖,制備雞胚成纖維細(xì)胞(CEF ,并分別運(yùn)用雞胚半數(shù)致死量(CELD 50法和組

3、織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID 50法測定DHV 的感染力。結(jié)果顯示,DHV-在SPF 雞胚內(nèi)成功增殖,致死雞胚具有典型臨床癥狀和體表特征,所增殖病毒的CELD 50和TCID 50分別為10-5.6/0.2mL 和10-5.12/0.1mL 。結(jié)果表明,該分離毒株毒力較強(qiáng),是進(jìn)行DHV 單克隆抗體研究的理想抗原。文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A論文編號(hào):2010-2541Proliferation and Infectivity of Duck Hepatitis Virus Type (DHV-Ma Shuangyu 1,Ding Yi 1,2,Wen Lizheng 2,Yuan Bao 2,Ren Wenz

4、hi 2(1College of Animal Science and Veterinary Medicine ,Jilin University ,Changchun 130062;2Laboratory Animal Center ,Jilin University ,Changchun 130062Abstract:For the preparation of Duck Hepatitis Virus type (DHV-Monoclonal Antibody,and to determine the DHV virulence.In this study,the proliferati

5、on of Duck Hepatitis Virus Type was based on SPF Chick Embryo.Preparation of chicken embryo fibroblasts (CEF,CELD 50and TCID 50were used tostronger,and it was an ideal antigen for Monoclonal Antibody to against DHV.Key words:DHV-;SPF chick embryo;CELD 50;TCID 50基金項(xiàng)目:吉林省科技平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目“吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測中心平臺(tái)建設(shè)”(20

6、071138和吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部2007年度青年基金資助項(xiàng)目。第一作者簡介:馬雙羽,女,1990年出生,陜西省寶雞市人,吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院2008級(jí)動(dòng)物科學(xué)專業(yè)本科生。Tel :0431-*,E-mail :happy08yuyu 。通訊作者:文力正,男,1976年出生,甘肅省慶城縣人,講師,碩士,研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測。通信地址:130062吉林省長春市西安大路5333號(hào)吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。Tel :0431-*,E-mail:wlzsydw 。收稿日期:2010-08-27,修回日期:2010-09-19。中國農(nóng)學(xué)通報(bào)2011,27(03:352-355Chinese A

7、gricultural Science Bulletin馬雙羽等:型鴨肝炎病毒(DHV-在雞胚中的增殖及感染力的測定1.2.1DHV 在SPF 雞胚中的增殖選擇9日齡SPF 雞胚30枚。接種前照蛋檢查,剔除死胚及弱胚。用碘酊和75%酒精消毒接種部位,在無菌環(huán)境中將用0.85%無菌生理鹽水100倍稀釋后的DHV 病毒液接種于雞胚尿囊腔,0.2mL/胚,用石蠟封孔。 接種DHV 后的雞胚置于孵化溫箱中培養(yǎng),控制相對濕度為60%,溫度為37.5左右,每日翻蛋2次,每天照蛋,棄去24h 內(nèi)死亡雞胚,收集2496h 內(nèi)死亡雞胚,超過96h 不死亡雞胚棄去。 無菌條件下用碘酊和75%酒精消毒雞胚氣室部位,

8、去除氣室蛋殼、殼膜和尿囊膜,然后吸出透明的尿囊液,-20凍存。小心取出死亡雞胚,觀察其形態(tài)變化。1.2.2DHV 感染力的測定將含有DHV 的SPF 雞胚尿囊液超濾除菌,連續(xù)進(jìn)行10倍的梯度稀釋,即10-1、10-2、10-310-8,共8個(gè)不同稀釋度,將各個(gè)稀釋度的病毒懸液分別接種9日齡SPF 雞胚,每個(gè)稀釋度接種8枚,0.2mL/枚,設(shè)對照胚3枚,接種0.2mL 0.85%的無菌生理鹽水。觀察記錄雞胚死亡情況,棄去24h 內(nèi)死亡雞胚,記錄18天內(nèi)死亡雞胚數(shù)。按Reed-Muench法計(jì)算雞胚半數(shù)致死量(CELD 509。取10日齡SPF 雞胚,無菌操作下取出雞胚,去除雞胚頭、四肢及內(nèi)臟,剪

9、碎,消化,加入DMEM 營養(yǎng)液,置于375%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待24h 后長滿單層時(shí)即可接種病毒。將含有DHV 的SPF 雞胚尿囊液超濾除菌,用Hanks 液連續(xù)進(jìn)行10倍的梯度稀釋至10-10,共10個(gè)稀釋度。將病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中,每一稀釋度接種一縱排共8孔,每孔接種100µL 。在每孔加入細(xì)胞懸液100µL ,設(shè)正常細(xì)胞對照,于375%的CO 2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),觀察5天并逐日記錄結(jié)果,按Reed-Muench 法計(jì)算組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID 509。2結(jié)果與分析2.1DHV 的增殖及致死雞胚形態(tài)DHV 病毒共接種30枚雞胚,除2枚雞胚于接種24h

10、內(nèi)由于污染死去外,共收獲2496h 內(nèi)死亡28枚,每枚收獲帶毒尿囊液38mL 。尿囊液病毒經(jīng)電鏡觀察可見直徑2040nm 的類球狀病毒(圖1。DHV 致死雞胚具有典型臨床癥狀和體表特征,胚胎發(fā)育遲滯、蜷縮,全身水腫,體表充血,頭頸和背部有出血點(diǎn)(圖2,3。2.2DHV 感染力測定結(jié)果DHV 雞胚半數(shù)致死量(CELD 50實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。圖1DHV的電鏡照片 圖2DHV 致死雞胚左為DHV 致死雞胚;右為正常雞胚圖3DHV 致死雞胚與正常雞胚的對比··353CELD50=10-5.6/0.2mL,表明將DHV病毒稀釋105.6倍,接種200µL可使50%的雞胚致死。

11、制備并培養(yǎng)CEF細(xì)胞(見圖4,接種感染DHV病毒(見圖5,組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。TCID50=10-5.12/0.1mL,表明將該病毒稀釋105.12倍接種100µL,可使50%的CEF細(xì)胞發(fā)生病變。病毒液稀釋度 死胚數(shù)活胚數(shù)累計(jì)死胚數(shù)活胚數(shù)累計(jì)死胚率/%表1DHV的雞胚半數(shù)致死量(CELD50測定結(jié)果注:死胚數(shù)為當(dāng)前稀釋度下的死胚數(shù);累計(jì)死胚數(shù)為到目前稀釋度為止,累計(jì)死胚數(shù);累計(jì)死胚率為當(dāng)前稀釋度下累計(jì)死胚數(shù)與總胚數(shù)的比率。圖4正常CEF照片圖5感染DHV的CEF照片表2DHV的組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50測定結(jié)果注:CPE:Cytopathic ef

12、fect(細(xì)胞病變。病毒液稀釋度 CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累計(jì)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累計(jì)CPE比率/%3討論型DHV可以在810日齡雞胚或1014日齡鴨胚中增殖。初代分離一般使用鴨胚,在經(jīng)鴨胚盲傳若干代后一般能適應(yīng)雞胚。雖然鴨胚接種要比雞胚敏感,而且產(chǎn)毒量也明顯高于雞胚12,但由于中國目前尚無SPF鴨場,而且鴨胚中往往含有母源抗體抑制DHV的增殖,所以在實(shí)驗(yàn)中大多用SPF 雞胚進(jìn)行病毒增殖。楊萍萍 13報(bào)道,DHV致死鴨胚的胚肝、胚膜和胚體中的病毒含量均高于尿囊液,建議病毒增殖后可以收獲上述材料。自發(fā)現(xiàn)鴨肝炎病毒以來,國外許多學(xué)者對該病毒的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了研究,但直到Wcocock1982年發(fā)現(xiàn)胎

13、牛血清中存在著鴨肝炎病毒非特異性抑制物后,病毒的細(xì)胞培養(yǎng)工作才有了較大的進(jìn)展。陳琨141994年··354馬雙羽等:型鴨肝炎病毒(DHV-在雞胚中的增殖及感染力的測定首先用鴨胚肝細(xì)胞培養(yǎng)了鴨肝炎病毒,認(rèn)為鴨肝炎病 毒對鴨胚肝細(xì)胞敏感?，F(xiàn)在一般認(rèn)為,弱毒株對細(xì)胞增殖的適應(yīng)性強(qiáng)于野生株,鴨胚細(xì)胞強(qiáng)于雞胚細(xì)胞,肝細(xì)胞優(yōu)于成纖維細(xì)胞。劉健15研究新型DHV在鴨胚肝細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)病毒接種于面積較大的容器,如細(xì)胞瓶中時(shí),細(xì)胞不易貼壁,很容易觀察到細(xì)胞破碎脫落;在面積很小的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上則很容易貼壁,且易觀察到病變細(xì)胞的顆粒變性和萎縮脫落。新型DHV病毒不同代次細(xì)胞培養(yǎng)的毒力之間

14、沒有明顯變化,而用鴨胚成纖維細(xì)胞增殖DHV,到第三代基本沒有細(xì)胞病變,認(rèn)為鴨胚成纖維細(xì)胞不適用于鴨肝炎病毒的培養(yǎng)。楊萍萍13發(fā)現(xiàn)不同株系對雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚肝細(xì)胞的適應(yīng)性不同,雞胚肝細(xì)胞要比雞胚成纖維細(xì)胞敏感得多。結(jié)果顯示,分離DHV毒株的CELD50和TCID50分別為10-5.6/0.2mL和10-5.12/0.1mL,表明該毒株毒力較強(qiáng),是進(jìn)行DHV單克隆抗體研究的理想抗原,為下一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1Levine P P,Hofstand M S.Duck disease inverstigationM.AnnuRep New York state vet.coli:Lt

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