治療乙型肝炎新藥肝龍膠囊的藥效學(xué)初步研究(一)

1、治療乙型肝炎新藥肝龍膠囊的藥效學(xué)初步研究(一)    作者：杜一民， 陳鴻珊 ， 李樹楠， 李壯， 李小兵， 張華明， 方春生 【關(guān)鍵詞】 肝龍膠囊；,鴨乙型肝炎病毒；,鴨乙肝動物模型；,實驗性肝損傷；,美洲大蠊摘要：目的觀察肝龍膠囊對鴨乙型肝炎病毒的抑制效果和對實驗性肝損傷的保護(hù)作用。方法（1）以鴨乙型肝炎病毒（DHBV）靜脈注射感染雛鴨為模型，于感染第7天后分組灌胃肝龍（GL）膠囊浸膏0.5，1.5，3.0 g?kg1?d1，陽性對照組給予無環(huán)鳥苷(ACV)或磷羧基甲酸鈉(PFA)。采用斑點雜交方法檢測鴨血清DHBVDNA，以病毒抑制率為療效指標(biāo)；（

2、2）以昆明種小鼠腹腔注射CCl4肝損傷為模型，給予GL浸膏(200 mg?kg1)。測定SGPT值，并取肝臟作病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果（1）GL三個不同劑量組對DHBV均有不同程度的抑制作用，有一定的量效關(guān)系；（2）GL降低CCl4肝損傷小鼠血清SGPT值并減輕肝細(xì)胞損傷。結(jié)論肝龍膠囊可抑制雛鴨體內(nèi)DHBVDNA的復(fù)制并能保護(hù)CCl4所致的小鼠肝損傷。關(guān)鍵詞：肝龍膠囊； 鴨乙型肝炎病毒； 鴨乙肝動物模型； 實驗性肝損傷； 美洲大蠊The Hepatic Pharmacological Effects of Ganlong Capsules in vivo.Abstract：ObjectiveTo

3、observe the antiviral activity of Ganlong Capsule against duck Hepatitis B virus( DHBV) and its protective effects on experimental liver injury in vivo.Methods(1) Experimental researches on antiviral activity of Ganlong Capsules against duck hepatitis B virus: The duck Hepatitis B model was made by

4、injecting DHBV into the veins of one-day-old Beijing duck on the seventh day after infected by DHBV, Ganlong Capsule was given by intragastric administration for 10 days to group I (0.5 g?kg1?d1), group II(1.5 g?kg1?d1), group III(3.0 g?kg1?d1), bid×10 d, and detected the levels of DHBV-DNA in

5、the duck blood sera obtained separately on the day before giving Ganlong Capsule, the fifth day and tenth day after giving Ganlong Capsule, and the third day after withdrawing Ganlong Capsule, by serum dotblot hybridization. The trial was compared with acyclovor(ACV) or phosphonoformate(PFA). (2) Pr

6、otective effects of Ganlong capsule on experimental liver injury in mice: Acute hepatic injury was induced by intraperitoneal injection of 0.2% CCl4 10 ml?kg1, Ganlong(200 mg?kg1) was given by intragastric or intraperitoneal administration for 2 days, bid. The serum SGPT were examined and the histop

7、athological changes of hepatic tissue was measured.Results(1)The results of three experiments showed that the levels of sera DHBVDNA decreased in the treatment groups of Ganlong, and in a dose-effect manner. The group III(3.0 g?kg1?d1) inhibited (P0.01) the serum DHBVDNA significantly, and after sto

8、pping the treatment for 6 days, serum DHBV-DNA level did not return significantly, and the inhibit effects were no different,compared with the treatment group of phosphonoformate(PFA) or acyclovor(ACV). (2) Ganlong(200 mg?kg1) could obviously inhibit the increase of serum SGPT, and histological exam

9、ination showed that hepatic damages of Ganlong treated mice were less severe than those of CCl4 control group.ConclusionThese results suggested that Ganlong Capsule markedly inhibited duck hepatitis virus replication and had protective effects on experimental hepatic injury in vivo.Key words：Ganglon

10、g Capsule; Hepatitis B virus; Animal hepatitis model; Experimental hepatic injury； Periplaneta americana L. 我國是乙肝高發(fā)國之一，乙型肝炎感染率高、危害嚴(yán)重。目前，用于治療乙肝的藥物有數(shù)百種，但仍缺乏理想的防治藥物。云南大理學(xué)院研制的治療乙肝的新藥肝龍膠囊，是國家實行新藥研究開發(fā)登記備案制以來，國家食品藥品監(jiān)督管理局正式登記在案的抗肝炎中藥新藥1，具有療效較好、價廉、給藥方便、無副作用等優(yōu)點2，目前已經(jīng)完成臨床試驗，正在申請試生產(chǎn)。該藥由提取自昆蟲美洲大蠊Periplaneta amer

11、icana L.的活性成分研制，對實驗性肝損傷有一定的保護(hù)作用，并能抑制雛鴨體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的復(fù)制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。1 材料1.1 藥物 肝龍膠囊和肝龍浸膏由云南大理醫(yī)學(xué)院藥理教研室研制，浸膏干粉用生理鹽水配成所需濃度或制成注射液；陽性對照藥物無環(huán)鳥苷(ACV)粉劑由湖北醫(yī)藥工業(yè)研究院提供，磷羧基甲酸鈉（PFA）粉劑由上海第十二制藥廠提供，臨用前均生理鹽水配成所需濃度。1.2 鴨乙型肝炎病毒 自然感染鴨乙型肝炎病毒的上海麻鴨血清，選用DHBVDNA強陽性者(+)，70保存?zhèn)溆谩?.3 動物 1日齡北京鴨，購自北京禽蛋養(yǎng)鴨場；昆明種小鼠，購自云南醫(yī)學(xué)實驗動物中心，體重1822 g，雌雄兼

12、有。1.4 主要試劑DHBVDNA探針：克隆自安徽廬江鴨DHBV全基因組（LJ76株）質(zhì)粒，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，32PdCTP標(biāo)記探針，購自北京福瑞生物技術(shù)工程公司；缺口翻譯藥盒購自普洛麥格公司(Promega Co.)；Sephadex G50、Ficoll、PVP，購自瑞典Pharmacia公司；SDS為西德Merck公司產(chǎn)品；魚精DNA、牛血清白蛋白為中國科學(xué)院生物物理所產(chǎn)品。硝酸纖維膜(0.45 m)，美國MSI公司產(chǎn)品。四氯化碳(CCl4)溶于芝麻油，濃度為0.2%。2 方法2.1 抑制雛鴨體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的復(fù)制實驗2.1.1 鴨乙型肝炎病毒感染 孵出24 h之內(nèi)的

13、北京鴨，經(jīng)靜脈注射上海麻鴨DHBVDNA陽性鴨血清，每只0.2 ml，在感染后7 d取血，分離血清，70保存待檢。2.1.2 藥物治療實驗感染DHBV 7 d后雛鴨分組進(jìn)行藥物治療實驗，每組68只；GL按3個劑量組口服給藥，分別為0.5，1.5，3.0 g?kg1?d1，bid×10 d；同批實驗設(shè)病毒對照組以生理鹽水代替藥物；陽性藥物對照組用ACV（0.4 g?kg1?d1）或PFA（0.5 g?kg1?d1）；各組分別在用藥前(T0)、用藥第5天(T5)、用藥第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，70保存待檢。共進(jìn)行3批試驗，其中第3批實驗觀察GL

14、的作用持續(xù)時間，并于停藥后第8天再取血1次。2.1.3 DHBV-DNA檢測方法取上述待檢血清，每批各組樣品同時點膜（30 l），測定鴨血清中DHBVDNA水平參照文獻(xiàn)3進(jìn)行。按缺口翻譯試劑盒說明方法，用32P標(biāo)記DHBVDNA探針，作鴨血清斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，用DG3022型酶標(biāo)檢測儀測定光密度值(OD值)(=490 nm)，以雜交斑點OD值作為鴨血清DHBVDNA水平值。2.2 對CCl4所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用實驗2.2.1 對CCl4所致小鼠肝損傷的預(yù)防作用及肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 小鼠30只，隨機分為3組，每組雄性8只，雌性2只。第1組作為對照組（給予生理鹽水20 ml?kg

15、1，ip，bid×2d）；第2，3組給予肝龍浸膏制劑，劑量均為200 mg?kg1，bid×2d，其中第2組給藥途徑為腹腔注射（ip）,第3組為灌胃（ig）；于實驗第3天，各組均給予0.2%CCl4芝麻油10 ml?kg1,ip。18 h后，全部小鼠眼眶取血，1 500 r/min離心分離血清，用賴氏法測定SGPT值。并取肝臟，用10%福爾馬林固定，作病理形態(tài)學(xué)觀察。為比較病理損害情況，將肝臟病損嚴(yán)重程度分為四級：(-)未見病變；(+)偶見個別肝細(xì)胞腫脹，少數(shù)炎癥細(xì)胞呈小灶性浸潤，(+)部分肝細(xì)胞腫脹，嗜酸性變，少數(shù)細(xì)胞壞死，以肝小葉中央靜脈周圍較為明顯，并有少量炎癥細(xì)胞浸

16、潤；(+)肝小葉中央靜脈擴張，小葉中央肝細(xì)胞變性壞死，壞死區(qū)約占小葉1/3至1/2，壞死區(qū)內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤，肝小葉周圍偶見壞死灶。2.2.2 對CCl4所致小鼠肝損害的治療作用實驗 小鼠30只，隨機分為3組，每組雄性7只，雌性3只，實驗第1天各組均給予0.2%CCl4芝麻油10 ml?kg1，ip。8 h后，第2，3組開始分別給予肝龍浸膏治療，劑量均為200 mg?kg1，bid×2d。其中第2組給藥途徑為腹腔注射（ip）,第3組為灌胃（ig）；第1組給予生理鹽水20 ml?kg1，ip，bid×2d，作為對照組。實驗第4天眼眶取血，測SGPT，肝組織作病理形態(tài)學(xué)觀察,方法

17、同前。2.2.3 SGPT測定采用賴氏法42.3 結(jié)果處理和統(tǒng)計分析鴨血清DHBVDNA OD490 nm值和SGPT值均采用均值(±s)。計算每組鴨不同時間血清DHBVDNA OD490 nm均值，并將每組鴨用藥后第5天、第10天和停藥后第3天血清DHBVDNA水平與給藥前比較，計算每組鴨用藥后不同時間和停藥后血清DHBVDNA的抑制率。DHBVDNA抑制率(I)=(給藥前OD值給藥后OD值)/給藥前OD值×100；統(tǒng)計學(xué)采用SPSS10.0軟件，單因素方差分析（OneWay ANOVA）。其中鴨血清DHBVDNA OD490 nm值將各給藥組不同時間DHBVDNA抑制率

18、分別與病毒對照相同時間的同一指標(biāo)比較，計算P1值，以確定療效。將各給藥組不同時間DHBVDNA抑制率分別與陽性藥物對照組相同時間的同一指標(biāo)比較，計算P2值，比較GL與陽性藥物之間的藥效差別。3 結(jié)果3.1 GL對雛鴨體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的抑制效果3.1.1 1日齡北京鴨感染DHBV后血清DHBVDNA動態(tài)3批實驗結(jié)果，包括放射自顯影斑點雜交照片和各組不同時間鴨血清DHBVDNA抑制率。結(jié)果見表1。表1 肝龍膠囊（GL）對DHBV感染雛鴨體內(nèi)DHBVDNA的抑制作用(略)給藥組治療不同時間的DHBVDNA抑制率分別與病毒對照組相應(yīng)時間DHBVDNA的抑制率比較： P10.05, P10.01；陽性

19、對照組不同時間DHBVDNA的抑制率分別與GL各劑量組相應(yīng)時間DHBVDNA的抑制率比較, P20.05, P20.01從實驗結(jié)果可見，雛鴨感染DHBV后第7天血清DHBVDNA均呈陽性，在整個實驗過程中，病毒對照組鴨血清DHBVDNA水平雖有一定程度的波動，但無顯著性差異。說明數(shù)值差別為鴨個體差異所致自然波動。3.1.2 陽性藥磷羧基甲酸鈉(PFA)和無環(huán)鳥苷(ACV)對DHBV感染鴨血清DHBVDNA的影響結(jié)果見表1。PFA給藥第5，10天和停藥后第3天對鴨血清DHBVDNA的抑制率分別為53.46%，80.65%和64.68%，ACV分別為65.87%，58.63%和34.15%。與病毒

20、對照組比較均有顯著性差異，表明PFA和ACV作為抗DHBV陽性藥作用是明顯的。證明實驗方法可靠。3.1.3 GL在DHBV感染鴨體內(nèi)對鴨血清DHBVDNA的影響GCL大劑量組(3.0 g?kg1?d1 )，給藥后第10天鴨血清DHBVDNA抑制率3批實驗分別為61.75%，58.14%和71.12%，接近陽性藥對照組同一時間的抑制率。給藥后不同時間鴨血清DHBVDNA抑制率與病毒對照組比較，第2，3批實驗在T5時有非常顯著性差異(P0.01)；第1，3批實驗在T10時有非常顯著性差異(P0.01)；并且在停藥后(P3或P6)差異亦有顯著性。提示肝龍大劑量組對鴨血清DHBVDNA有明顯的抑制作用

21、。療效顯著，并且作用持續(xù)時間較長。GL中、小劑量組3批實驗在T5，T10時均顯示對DHBVDNA有明顯的抑制作用。但與大劑量組比較，療效仍有一定的差距。表明GL的不同劑量組之間有一定的量效關(guān)系。3.1.4 GL與陽性藥PFA和ACV的效果比較GL各劑量組與陽性藥PFA和ACV組的DHBVDNA抑制率比較，除第1批實驗的中、小劑量組分別在T5和T10明顯低于PFA外，第1批實驗的大劑量組及第2，3實驗的各劑量組不同時間的抑制率與PFA或ACV比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。3.2 GL對CCl4所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用3.2.1 GL對CCl4所致小鼠肝損傷的預(yù)防作用及肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察由表2可見，

22、給小鼠GL（ip或ig）能對抗CCl4肝損害所引起的SGPT值升高,其中灌胃組有統(tǒng)計學(xué)意義。從肝臟損害程度看，給予GL能一定程度預(yù)防小鼠肝損傷，而CCl4 對照組均肝損傷嚴(yán)重(+級)。表2 預(yù)先給予肝龍浸膏對CCl4所致小鼠SGPT及其肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響(略)* P0.05； ip: 腹腔注射給藥；ig: 灌胃給藥3.2.2 GL對CCl4肝損害小鼠的治療作用由表3可見，肝龍可使受損肝組織恢復(fù)加速。腹腔注射肝龍組SGPT降低顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。肝臟病變程度，對照組10只均為(+)級，而肝龍腹腔注射和灌胃組分別有3只和2只小鼠肝臟損傷程度較輕(+級)。表3 肝龍浸膏對CCl4肝損害的治療作用及其肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響(略)* P0.05； ip: 腹腔注射給藥；ig: 灌胃給藥4 討論治療肝炎的藥物主要是通過殺滅病毒、增強機體免疫功能、抗壞死、抗脂肪變性、抗炎、促再生、抗纖維化等機制發(fā)揮療效。CCl4所致肝損傷是其被還原而產(chǎn)生氧自由基，后者與膜脂質(zhì)和膜蛋白共價結(jié)合引起肝細(xì)胞壞死5。本實驗證實肝龍有一定的抗壞死作用，能降低由CCl4所致的小鼠高SGPT值，病理形態(tài)觀察時還發(fā)現(xiàn)給予肝龍的某些小鼠受損肝臟有明顯再生