存活蛋白重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)

1、存活蛋白重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)    作者：朱雄鵬，陳志哲，林旭，胡建達(dá)，李純團(tuán)，楊婷，許貞書，呂璐璐，陳彩平，張浪輝    【摘要】 本研究旨在構(gòu)建含有人存活蛋白（survivin）基因的重組腺病毒載體，并探討其在轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)。以質(zhì)粒pcDNA3.0-survivin為模板，通過PCR 擴(kuò)增獲得survivin基因全長序列。PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)酶切，定向插入腺病毒穿梭質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-survivin。通過雙酶切、PCR及插入片段測序鑒定后，將正確重組體pSh

2、uttle-CMV-survivin 轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183 菌（含腺病毒骨架質(zhì)粒）并進(jìn)行同源重組，然后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，將此重組腺病毒質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切、線性化、純化，用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞。制備病毒上清并測定其滴度，將病毒上清轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，應(yīng)用Western blot方法分析survivin的表達(dá)。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了含有人survivin基因的重組腺病毒，病毒滴度為： 2.65×109pfu/ml。Western blot鑒定顯示，經(jīng)重組腺病毒轉(zhuǎn)染的DC可有效表達(dá)survivin。結(jié)論：含survivin基因的重組腺病

3、毒載體的構(gòu)建成功，為下一步開展抗白血病免疫研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。    【關(guān)鍵詞】 腺病毒載體；存活蛋白基因；樹突狀細(xì)胞 Construction of Recombinant Adenovirus Vector Containing Human Survivin Gene and Its Expression in Dentritic Cells Abstract    The study was aimed to construct the recombinant adenovirus vectors contai

4、ning human survivin gene，and to investigate their expression in transfected dentritic cells. Full length cDNA encoding survivin was obtained by PCR amplification from plasmid pcDNA3.0-survivin. The PCR product was restricted，and then inserted into pShuttle-CMV. The plasmids of pShuttle-CMV-survivin

5、were linearized with Pme，and the fragment containing survivin was ligated with pShuttle-CMV and transfected into E.coli BJ5183. After homologous recombination in bacteria，the extracted plasmid from the positive bacteria were linearized with Pac，transfected into HEK293 cells with liposome Lipofectami

6、neTM 2000. Then，the harvested adenovirus supernatants were transfected into dendritic cells. The results showed that the recombinant adenovirus-survivin was constructed successfully and its titer was about 2.65×109 pfu/ ml. The expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed

7、 by Western blot analysis. It is concluded that the recombinant adenovirus vector containing human survivin was constructed successfully，which may provide preliminary laboratory evidence for anti-leukemia immunotherapy. Key words adenovirus vector; survivin gene; dendritic cell 重組腺病毒載體具有宿主細(xì)胞范圍廣、高轉(zhuǎn)移效

8、率、高滴度和高表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，是目前基因治療研究中應(yīng)用最為廣泛的載體之一1-3。存活蛋白（survivin）基因是腫瘤組織較為特異的基因，因而其編碼蛋白survivin成為腫瘤較理想的靶抗原之一。為開展樹突狀細(xì)胞(DC)介導(dǎo)的抗白血病免疫治療，我們采用一種新的細(xì)菌內(nèi)同源重組制備重組腺病毒的AdEasyTM XL系統(tǒng)，構(gòu)建了survivin基因重組腺病毒，制備了高滴度的病毒上清，并感染人樹突狀細(xì)胞，為下一步開展DC瘤苗治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料和方法 材料 質(zhì)粒pcDNA 3.0-survivin由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科、全軍優(yōu)生優(yōu)育研究所成勝權(quán)副教授惠贈；濃縮白細(xì)胞由省血液中心提供； AdEa

9、syTM XL腺病毒系統(tǒng)為Stratagene公司產(chǎn)品；高保真DNA聚合酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；普通Taq酶為晶美公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶 Kpn、Hind、Pme、Pac、T4連接酶為BioLabs產(chǎn)品；純化試劑盒、小量抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購于中科開瑞公司；質(zhì)脂體、低熔點(diǎn)瓊脂糖為Invitrogen公司產(chǎn)品； PCR純化試劑盒、-半乳糖苷酶檢測試劑盒為Stratagene公司產(chǎn)品；總蛋白裂解酶、蛋白酶抑制劑為美國Pierce公司產(chǎn)品；兔抗人Survivin多克隆抗體為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品；辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG、Western-Blotting lunimol試劑為Santa C

10、ruz公司產(chǎn)品。 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中survivin mRNA的系列BC034148及腺病毒穿梭載體（pShuttle-CMV vector）的酶切位點(diǎn)（Kpn1和Hind）分別設(shè)計(jì)了引物，F(xiàn)： 5-CGGGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTG-3，R： 5-CCCAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAG-3。 目的片段的獲得 以pcDNA3.0-survivin為模板，用合成的引物作PCR擴(kuò)增，體系為25 l，其中含10 ×buffer 2.5 l，dNTP (10 mmol/L) 0.5 l，模板質(zhì)粒0.5 l，上下游引物各0.5 l，Taq 酶0.

11、1 l。熱循環(huán)程序?yàn)? 94預(yù)變性2分鐘，94變性30秒，55退火30秒，72延伸1分鐘，30 個(gè)循環(huán)后，72 再延伸7分鐘，4 保存。取10 l PCR反應(yīng)液在1%瓊脂糖中進(jìn)行電泳。然后采用的純化試劑盒，按照說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。 穿梭載體的構(gòu)建 用Kpn1和Hind兩種內(nèi)切酶對survivin純化產(chǎn)物和pShuttle-CMV vector進(jìn)行酶切，將得到的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。利用小牛腸堿性磷酸酶對載體酶切片段進(jìn)行磷酸化處理，得到的產(chǎn)物片段survivin和載體，用T4 DNA連接酶在4條件下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5細(xì)胞，并通過帶有卡那霉素（50 g/ml）的

12、LB平板篩選出帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌。然后以菌液為模板，用腺病毒載體通用引物進(jìn)行擴(kuò)增以篩選出帶有目的片段的細(xì)菌，用小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒得到重組質(zhì)粒（pShuttle-CMV-survivin），送泰京公司測序。 腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 同源重組    將帶有正確目的片段的穿梭載體（pShuttle-CMV-survivin）和對照質(zhì)粒（pShuttle-CMV）分別用Pme1進(jìn)行線性化，然后從凝膠中回收，并用來分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞（已含有病毒質(zhì)粒AdEasy-Vector）。用加卡那霉素（50 g/ml）的LB平板篩選帶有同源重組質(zhì)粒的E.

13、coli BJ5183，抽提質(zhì)粒，Pac1酶切鑒定。同源重組成功的質(zhì)粒，用腺病毒通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定重組質(zhì)粒是否帶有目的片段。之后用大抽質(zhì)粒試劑盒HiSpeedTM Plasmid Purification kit，分別從含有同源重組質(zhì)粒（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV）的菌液進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提，以備轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝病毒時(shí)用。    腺病毒的包裝    取同源重組質(zhì)粒5 g，用3 l的內(nèi)切酶Pac1進(jìn)行線性化，然后用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物利用質(zhì)脂體LipofectamineTM

14、 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染匯合度達(dá)到70%的293細(xì)胞。到第8天時(shí)，細(xì)胞大部分飄浮。用滴管把剩下貼壁的細(xì)胞吹起，收集細(xì)胞，離心，棄掉上清，加入1 ml PBS，重懸細(xì)胞，然后移到1.5 ml EP管中。在-70冰箱與37水浴反復(fù)凍融細(xì)胞4次，12 000×g離心10分鐘，收集上清，即為原代病毒上清（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV），置-70冰箱中保存。腺病毒的擴(kuò)增、滴度測定 將得到的原代病毒上清轉(zhuǎn)染匯合度為70%的293細(xì)胞，按以上方法收集病毒。然后再將得到的病毒上清轉(zhuǎn)染兩瓶50 cm2 T形瓶、匯合度為70%的293細(xì)胞，利用空斑測定法對收集的病毒上清進(jìn)行滴度測定，最后放置-

15、70冰箱中保存。 腺病毒介導(dǎo)survivin在DC的表達(dá) DC的誘導(dǎo)    利用淋巴細(xì)胞分離液從濃縮白細(xì)胞中分離出單個(gè)核細(xì)胞，利用貼壁法得到單核細(xì)胞，加入生長因子GM-CSF、IL-4到培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)，濃度皆為1 000 U/ml，隔天半換液，并補(bǔ)充生長因子。到第7天加入TNF-，使其終濃度達(dá)50 ng/ml，到第9天收集細(xì)胞。 外源基因survivin蛋白表達(dá)的Western blot鑒定    在DC培養(yǎng)到第7天加入TNF-的同時(shí)，按MOI為100分別用腺病毒Ad-CMV-survivin、Ad-CMV感染D

16、C。第9天收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染Ad-SVV(survivin)病毒的DC，加入總蛋白裂解酶100 l和蛋白酶抑制劑1 l，冰浴30分鐘，4，13 000×g，離心10分鐘。取上清直接于凝膠加樣孔內(nèi)，進(jìn)行電泳（濃縮膠60 V，1小時(shí)；分離膠100 V，2小時(shí)）。當(dāng)電泳即將結(jié)束時(shí)，從電泳槽上取下凝膠，將NC膜放于凝膠上方，濾紙放在NC膜上，置入轉(zhuǎn)膜裝置中，120 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)移2-3小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置封閉液中，用封閉液11 000稀釋特異性兔抗人存活蛋白（survivin）抗體。將膜從封閉液中取出，置于抗體稀釋液內(nèi)，4振蕩雜交過夜。用封閉液稀釋酶標(biāo)二抗；將膜置于稀釋的酶標(biāo)二抗中，室溫振蕩

17、反應(yīng)30-60分鐘；浸入新鮮配制的顯色液中，于暗處顯色10-30分鐘；顯色完全后用大量雙蒸水洗滌以終止反應(yīng)。 結(jié)果 目的基因的獲得 通過PCR反應(yīng)，從pcDNA3.0-SVV質(zhì)粒中擴(kuò)增的SVV基因片段，其長度為445 bp。 重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-survivin 的鑒定 PCR鑒定    分別以重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-survivin為模板，用合成的腺病毒穿梭載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約588 bp的目的片段，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖1。    測序鑒定 

18、0;  為確保重組質(zhì)粒pShuttle-survivin中插入序列及讀碼框架的正確性，送測序鑒定，所得測序結(jié)果與GenBank文獻(xiàn)報(bào)道一致。 pAd-survivin、pAd-CMV、pAd-LacZ同源重組質(zhì)粒的鑒定 酶切鑒定    用Pac分別酶切腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-Survivin、pAd-CMV、pAd-Lac，后者均可得到30 kb和4.5 kb兩個(gè)片段。 PCR鑒定    分別以pAd-survivin、pAd-CMV、pAd-LacZ同源重組質(zhì)粒為模板，用前面合成的腺病毒穿梭載體

19、通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察大約594 bp、588 bp、143 bp、3 190 bp左右(圖2)。 重組腺病毒的滴度測定 利用空斑測定法測定病毒滴度為：Ad-SVV 2.65×109pfu/ml。 樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)第9天，倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞呈懸浮生長，胞體較大，細(xì)胞表面有樹突狀突起；透射電鏡觀察具有典型的樹突狀突起。用流式細(xì)胞儀檢測DC表面表型為：高表達(dá)CD86、CD83、CD80和HLA-DR。 外源基因SVV蛋白表達(dá)的Western blot鑒定 通過Western blot鑒定SVV蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示： 16.5 kD處可見

20、一陽性條帶，提示經(jīng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC可有效表達(dá)外源基因SVV蛋白，而未轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的DC未檢出SVV蛋白表達(dá)(圖3)。 討 論 選擇合適的基因轉(zhuǎn)移載體是基因治療成敗的重要因素。腺病毒載體由于其基因組結(jié)構(gòu)簡單，病毒滴度高，可感染分裂和不分裂的靶細(xì)胞，對細(xì)胞的感染率高，可導(dǎo)入各種組織細(xì)胞，一般不會有插入突變的危險(xiǎn)。因此，重組腺病毒已成為目前基因免疫治療最常用的載體之一。    本實(shí)驗(yàn)采用的AdEasyTM XL腺病毒系統(tǒng)為E1、E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷5型腺病毒，它由于刪除了E1、E3區(qū)基因，不僅使病毒不能自我復(fù)制，而且有利于外源DNA的插入。該系統(tǒng)中的BJ 5183

21、細(xì)胞含有病毒骨架質(zhì)粒pAd-Easy（帶有病毒的大部分基因組），該特性可顯著地降低由于非重組穿梭質(zhì)粒所引起的背景，使其更容易獲得含有重組腺病毒質(zhì)粒的克隆。在實(shí)驗(yàn)中為保證PCR反應(yīng)的特異性，我們設(shè)計(jì)了針對目的片段的基因特異性引物，采用了高保真的Taq酶，從而大大地降低了堿基錯誤插入的機(jī)率，順利獲得了SVV基因片段，經(jīng)測序結(jié)果分析沒有發(fā)現(xiàn)堿基突變，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程得以順利進(jìn)行。    本研究構(gòu)建的survivin基因是一個(gè)抗凋亡基因，它全長14.47 kb，含有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，編碼由142個(gè)氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約為16 389 D的蛋白質(zhì)。它在正常

22、成人組織中不表達(dá)，而在人類大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)，故可認(rèn)為是腫瘤組織較為特異的基因。因此，SVV蛋白成為腫瘤較理想的靶抗原之一。Pisarev等4應(yīng)用含有突變體survivin 的Ad載體轉(zhuǎn)染DC，有效地誘導(dǎo)出特異免疫反應(yīng)，因此該作者認(rèn)為Ad是基因?qū)隓C最有效的方法。Ad的另外優(yōu)點(diǎn)在于它是十分重要的潛在免疫反應(yīng)刺激物，能夠誘導(dǎo)DC成熟5-7。一些研究也證明，表達(dá)抗原基因的病毒載體感染的DC能有效地呈遞抗原，激發(fā)抗原特異性的免疫反應(yīng)8-11。    綜上所述，本研究成功制備攜帶SVV基因的重組腺病毒，并在DC中表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行抗白血病免疫治療奠定了實(shí)驗(yàn)基

23、礎(chǔ)。 【參考文獻(xiàn)】 1 Nasz I，Adam E. Recombinant adenovirus vectors for gene therapy and clinical trials. Acta Microbiol Immunol Hung，2001;48: 323-3482 Mizuguchi H，Kay MA，Hayakawa T. Approaches for generating recombinant adenovirus vectors. Adv Drug Deliv Rev，2001; 52:165-176    3 Danthinn

24、e X，Imperiale MJ. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Ther，2000;7:1707-17144 Pisarev V，Yu B，Salup R，et al. Full-length dominant-negative survivin for cancer immunotherapy. Clin Cancer Res，2003; 9 :6523-65335 Nikitina EY，Chada S，Muro-Cacho C，et al. An effective immunizat

25、ion and cancer treatment with activated dendritic cells transduced with full-length wildtype p53. Gene Ther，2002; 9: 345-3526 Okada N，Masunaga Y，Okada Y，et al. Gene transduction efficiency and maturation status in mouse bone marrow-derived dendritic cells infected with conventional or RGD fiber-muta

26、nt adenovirus vectors. Cancer Gene Ther，2003; 10: 421-4317 Herrera OB，Brett S，Lechler RI. Infection of mouse bone marrow-derived dendritic cells with recombinant adenovirus vectorsleads to presentation of encoded antigen by both MHC class I and class II molecules-potential benefits in vaccine design. Vaccine，2002; 21: 231-2428 Tsang KY，Zhu M，Even J，et al. The infection of human dendritic cels with recombinant avipox vectors expressing a costimulatory molecule transgene (CD80) to enhance the activ