宮頸鱗狀細胞癌和尖銳濕疣中細胞凋亡的研究

1、宮頸鱗狀細胞癌和尖銳濕疣中細胞凋亡的研究人類乳頭瘤病毒(HPV)感染皮損增生的原因可能是細胞分裂增加和(或)感染HPV的細胞死亡減少1,2。我們探討了宮頸鱗狀細胞癌和外陰、宮頸尖銳濕疣中細胞凋亡情況及其與Ki67指數(shù)的關(guān)系。 一、實驗材料1病例：16份宮頸鱗狀細胞癌標本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院門診及住院確診的宮頸鱗狀細胞癌患者。10份宮頸尖銳濕疣及10份外陰尖銳濕疣標本來自北京協(xié)和醫(yī)院。對照組取自皮膚科及婦產(chǎn)科門診手術(shù)：正常宮頸標本4份，外陰正常皮膚標本5份。取材方法為常規(guī)消毒，2利多卡因局部麻醉，切口或鉆孔取材，常規(guī)3.33mol/L(10)中性福爾馬林固定，石蠟包埋，室溫存放。2鼠抗人單

2、克隆Ki67抗體（購自SantaCruz公司），稀釋度1100。鏈霉親和素(SPTM)簡化免疫組化試劑盒，美國LabVision公司生產(chǎn)(購自北京岳泰科技有限公司)。凋亡試劑盒(BoehringerMannheim，熒光標記)。華美生物工程有限公司設(shè)計3對HPV引物，擴增4型HPVDNA的高保守區(qū)E6區(qū)。HPV6/11：5GGAGGGACCGAAAACGGTTCAACC3，5GCAAAGAAAGATTAAACGTCTTGC3，產(chǎn)物大小145bp；HPV16:5ATTAGTGAGTATAGACATTA3，5GGCTTTTGACAGTTAATACA3，產(chǎn)物大小110bp；HPV18:5GGCACA

3、ACCTAGGAGTTTCG3，5TGCAGCAGCACGAATGGCACTGG3，產(chǎn)物大小440bp。二、實驗方法(一)PCR方法檢測HPVDNA：1.樣品DNA的制備：從石蠟包埋組織塊上切下510m厚的切片，放入0.5mL試管中，二甲苯脫蠟,20.63mol/L(95)乙醇沖洗，真空干燥，然后加入100L消化緩沖液(50mmol/LTris5L,pH8.5,1mmol/LEDTA1L,0.5吐溫200.5L，蛋白酶K20L，雙蒸水73.5L),55孵育3h，此消化液即為制備的樣品DNA。2.多對引物PCR：25LPCR體系包括1.5UTaqDNA聚合酶，2.5L樣品DNA，每種引物50pm

4、ol(共3對)，200mol/LdNTPs和PCR緩沖液，進行30次循環(huán)擴增，包括9530s，401min，721min，最后1個循環(huán)結(jié)束后725min，使合成的DNA延伸，每次反應(yīng)包括陽性對照(加入HPV6、16、18質(zhì)粒)和陰性對照(不加樣品DNA，加入2.5L去離子水)，擴增后，取15L擴增產(chǎn)物加在質(zhì)量分數(shù)為2的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下拍照分析結(jié)果。(二)免疫組化同Shoji等3所述。Ki67指數(shù)：1000個表皮細胞(正常組織和尖銳濕疣)或1000個腫瘤細胞中細胞核著棕褐色數(shù)目的百分比。(三)Tunnel法按說明書進行。熒光顯微鏡下計數(shù)，共聚焦顯微鏡下照相。陰性對照不加T

5、unnel混合液，陽性對照加DNase。凋亡指數(shù)：1000個表皮細胞中細胞核著黃或黃綠色數(shù)目的百分比。三、結(jié)果1.HPVPCR檢測結(jié)果：16份宮頸鱗狀細胞癌、10份宮頸尖銳濕疣、10份外陰尖銳濕疣石蠟標本中HPV6/11、HPV16、HPV18檢測結(jié)果顯示,宮頸鱗狀細胞癌HPV16陽性13例，宮頸尖銳濕疣HPV6/11陽性9例，外陰尖銳濕疣HPV6/11陽性9例。正常皮膚及宮頸正常粘膜未檢測到HPV。2.Ki67指數(shù)：正常宮頸粘膜和正常皮膚Ki67陽性細胞數(shù)少。宮頸及外陰尖銳濕疣，Ki67陽性細胞分布于表皮或粘膜1/32/3層的上皮細胞中。宮頸鱗狀細胞癌中多數(shù)腫瘤細胞著色。3.Tunnel法檢

6、測凋亡結(jié)果：正常宮頸粘膜及外陰皮膚中未檢測到凋亡細胞。宮頸及外陰尖銳濕疣中可見少數(shù)凋亡細胞，散在分布于表皮中，部分病例中未見到凋亡細胞。宮頸鱗狀細胞癌中可見較多的凋亡細胞。具體結(jié)果見表1。宮頸鱗狀細胞癌與尖銳濕疣Ki67指數(shù)比較，t=9.35,P0.05。宮頸鱗狀細胞癌與尖銳濕疣凋亡指數(shù)比較，t=8.6,P0.05。表1宮頸鱗狀細胞癌和外陰，宮頸尖銳濕疣Ki67指數(shù)和凋亡批數(shù)例數(shù)Ki67指數(shù)凋亡指數(shù)宮頸鱗狀細胞癌16宮頸尖銳濕疣10外陰尖銳濕疣1017.22外陰和宮頸尖銳濕疣20 四、討論 我們的結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細胞癌中凋亡細胞數(shù)增加多于尖銳濕疣，宮頸尖銳濕疣和外陰尖銳濕疣中凋亡細胞無差別。

7、免疫組化結(jié)果顯示宮頸鱗狀細胞癌中Ki67增生指數(shù)高于尖銳濕疣，宮頸和外陰尖銳濕疣中Ki67指數(shù)無差別。其原因可能是宮頸鱗狀細胞癌中細胞向成熟細胞分化的能力減弱，甚至喪失，故宮頸鱗狀細胞癌中細胞凋亡數(shù)多于尖銳濕疣，提示凋亡有助于消除多余的腫瘤細胞。White等4發(fā)現(xiàn)高危型HPVE7蛋白比低危型HPVE7蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡明顯。本文結(jié)果也支持宮頸鱗狀細胞癌和尖銳濕疣中凋亡的發(fā)生與HPV型別或增生程度有關(guān)，但發(fā)生于不同部位的尖銳濕疣無差異。晉紅中（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院北京，100730）王家璧（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院北京，100730）劉躍華（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)

8、院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院北京，100730）參考文獻1，Demeter LM, Stoler MH, Broker TR, et al. Induction of proliferating cell nuclear antigen in differentiated keratinocytes of human papillomavirus infected lesions. Hum Pathol, 1994， 25:343 348.2， al Saleh W, Delvenne P, Greimers R, et al. Assessment of Ki 67 antigen im

9、munostaining in squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix: correlation with the histologic grade and human papillomavirus type. Am J Clin Pathol, 1995,104:154 160.3， Shoji Y,Saegusa M,Takano Y,et al.Correlation of apoptosis with tumour cell differentiation,progression,and HPV infection in cervical carcinoma.J Clin Pathol, 1996,49:134 138.4， White AE,Livanos EM,Tlsty TD. Diff