最新 離子通道綜述文章

1、1.1 生物膜早期研究離子通道的早期研究主要來源于電生理學(xué)研究。早在1890 年, 德國的物理化學(xué)家Wilhelm Ostwald（1909 年諾貝爾化學(xué)獎獲得者），基于人工合成的膠質(zhì)膜實驗，提出活細胞產(chǎn)生的電信號可使離子在細胞中穿梭理論。到了1900年，他的這種電化學(xué)思想才被認可，后來研究表明，膜電位本質(zhì)上是電化學(xué)。到了上世紀初期（1902-1912年）伯恩斯坦（JBetnstein，1902）最先提出“膜學(xué)說”并用此解釋生物電的產(chǎn)生。他認為靜息時細胞膜只對鉀離子有通透性，由于細胞內(nèi)外鉀離子濃度不同，因此兩側(cè)出現(xiàn)內(nèi)負外正的電位差。當(dāng)細胞受到刺激而興奮時，細胞膜暫時失去對離子的選擇性，所有離子

2、都能通過，因此，膜兩側(cè)的電位差暫時消失。到了1925年，Michaelis 提出可能存在窄離子通道。在早期膜生物物理研究階段，興奮膜離子理論從未經(jīng)試驗驗證的假說發(fā)展成為公認的理論，這一時期的主要貢獻在于確定生物點活動與離子通透性的關(guān)系，但尚未明確建立離子通道的概念。1.2 離子通道經(jīng)典研究時期在1950-1960期間，兩位英國科學(xué)家Hodgkin 和Huxley，基于烏賊大軸突為材料作的生理實驗,使用電壓鉗位技術(shù)，證實跨膜電位決定于細胞膜的離子通透性，從而對鉀、鈉離子通透性變化作了詳細的分析并提出著名的“Na+，K+雙通道模型”和離子學(xué)說。Hodgkin 和Huxley 的離子學(xué)說解釋了生物電

3、的起源。他們也因此共同獲得1963 年的諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎。到了1965-1975年：Hille 基于藥理學(xué)的方法，研究鈉鉀通道結(jié)構(gòu)以及選擇性通透機制，同時Armstrong基于有關(guān)肌肉興奮收縮偶聯(lián)的實驗，研究門控與膜電壓之間的關(guān)系。倆人皆因?qū)﹄x子通道選擇通透性及門控機制的突出研究貢獻共同獲1999年拉斯克醫(yī)學(xué)獎。這一時期是離子通道的經(jīng)典研究時期，離子通道模型的建立以及通道選擇性和通透性機制的研究都有了很大突破，為離子通道的進一步飛躍發(fā)展研究做了很好的鋪墊。1.3 生物膜離子通道飛躍發(fā)展時期1981年，德國科學(xué)家Neher 和Sakrmann 發(fā)明了膜片鉗技術(shù)，使用這項技術(shù)可以直接記錄離子單通道

4、電流從而證實細胞膜上離子通道的存在，闡釋單個離子通道的功能。膜片鉗技術(shù)為從分子水平上研究離子通道提供直接手段。兩位科學(xué)家也因為發(fā)明膜片鉗技術(shù)獲得一九九一年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。1990 年，美國科學(xué)家P. Agre通過細胞對比實驗發(fā)現(xiàn)并描述了第一個水通道蛋白質(zhì)。1998 年，美國科學(xué)家Mackinnon（2003年諾貝爾化學(xué)獎獲得者）從鏈霉菌中獲得了第一個離子通道的高精度結(jié)構(gòu)（KcsA）首次在原子水平上解釋了離子通道功能結(jié)構(gòu)及機制。這一時期是生物膜離子通道的飛躍發(fā)展時期，隨著膜片鉗技術(shù)的使用以及生化技術(shù)的進步，人們已經(jīng)分離純化出許多不同的通道蛋白,開始直接研究離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，使離子通道的研究

5、有了飛躍發(fā)展。2.離子通道本質(zhì)特征與分類所謂離子通道，其實質(zhì)就是細胞膜上的一種蛋白結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)類似細胞內(nèi)外之間的門和通道，故稱離子通道。其功能是選擇性讓一些離子進出細胞。離子通道的主要特性有：選擇性開關(guān)性（可控性）飽和性。即不同的離子通道對不同離子的通透性有明顯差別，運輸速度和細胞膜上離子通道密度有關(guān)？離子通道是一種具有對離子選擇性孔和門控機制的結(jié)構(gòu)。因此根據(jù)門控機制的不同，可以把離子通道分為:電壓門控離子通道、配體門控離子通道、環(huán)核苷酸門控離子通道、機械力敏感的離子通道。根據(jù)不同離子通道對離子的選擇性不同，可以把離子通道分為鈉離子通道、鈣離子通道、鉀離子通道、TRP通道、水通道。3離子通道的

6、實驗研究方法3.1電壓固定（Voltage-Clamp）技術(shù)19491952年,Hodgkin和 Huxley發(fā)明了“電壓固定技術(shù)”。電壓固定技術(shù)的原理是用負反饋的電子線路將膜電位固定在實驗所希望的一定值上，同時測量膜電流的變化，以電壓與電流之比求出膜電導(dǎo)的變化。這項技術(shù)的發(fā)明為離子通道的通透性的研究提供了技術(shù)條件。同時成為可興奮細胞膜電生理研究的基本手段與分析方法。Hodgkin 和 Huxley 也因用此技術(shù)在烏賊神經(jīng)軸突上測得了的離子流獲得1963年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎。3.2 膜片鉗（patch clamp ）技術(shù)1976年德國細胞生理學(xué)家 Neher 和 Sakmann 獨創(chuàng)了“膜片鉗技

7、術(shù)”。膜片鉗技術(shù)的原理是利用負反饋電子線路，通過微電極與細胞之間形成緊密接觸的方法，將微電極尖端所吸附的一個至幾個平方微米的細胞膜的電位固定在一定水平上，對通過通道的微小離子電流作動態(tài)或靜態(tài)觀察，從而研究其功能。這項技術(shù)的發(fā)明為研究離子單通道的門控動力學(xué)特征及通透性、選擇性膜信息提供了最直接的手段。膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)立取代了電壓鉗技術(shù)，是細胞電生理研究的一個飛躍，使得離子通道的研究，從宏觀深入到微觀。Neher 和 Sakmann也因膜片鉗技術(shù)的發(fā)明獲得了1991 年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎獲 。 膜片鉗技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的研究離子通道的有效實驗方法。近年來，膜片鉗技術(shù)與現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)結(jié)合

8、起來研究單個的生物細胞已取得了新的進展 。3.3全自動膜片鉗技術(shù)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個細胞（或一對細胞），這對于藥物開發(fā)初期和中期的大量化合物篩選來說是一項耗時耗力的工作，同時它也不適合需要記錄大量細胞的基礎(chǔ)實驗研究。因此科研人員進行研究創(chuàng)新后發(fā)展了全新的應(yīng)用于藥物篩選的全自動膜片鉗技術(shù)。這種全自動膜片鉗技術(shù)通量高，一次能記錄幾個甚至幾十個細胞，而且從找細胞、形成封接、破膜等整個實驗操作實現(xiàn)了自動化，免除了這些操作的復(fù)雜與困難，工作效率大大提高。目前全自動膜片鉗技術(shù)已經(jīng)廣泛的用于藥物篩選。3.4穿孔膜片鉗（perforated patch clamp ）技術(shù)膜片鉗技術(shù)有著眾多優(yōu)勢，但在

9、實驗中仍然會有不可避免的缺陷，那么如何減少對細胞的損傷，克服機械穩(wěn)定性差，從而更準(zhǔn)確的記錄離子通道電流？1988 年Horn 等對傳統(tǒng)全細胞記錄進行了改進,建立了穿孔膜片鉗技術(shù)(perforated patch clamp technique)。這種新技術(shù)是利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性質(zhì),將這類抗生素充灌在電極液中,在高阻封接形成之后自發(fā)性形成的全細胞模式。穿孔膜片鉗技術(shù)可以更有效真實的反應(yīng)通道電流的電生理特性，因此在對離子通道電流的研究中應(yīng)用越來越廣泛。但這種技術(shù)也有它自身的缺陷，它對離子選擇性的分子基礎(chǔ)目前尚不清楚,在記錄全細胞電流的過程中可能出現(xiàn)再封口，從而影響實驗結(jié)果

10、。3.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，由美國珀金-埃爾默公司的Dr. Mullis于1983年發(fā)明，PCR技術(shù)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，將一條DNA序列不斷加以復(fù)制，使其數(shù)量以幾何級數(shù)方式增加，就可用來做定性的分析及各式各樣的應(yīng)用。并利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)的大量合成。目前常用的技術(shù),可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。PCR技術(shù)的發(fā)明有著跨時代的意義，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。目前這項技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得

11、以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。3.6 X射線衍射技術(shù)與蛋白質(zhì)結(jié)晶生物大分子單晶體的X射線衍射技術(shù)是50年代以后,首先從蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)研究中發(fā)展起來的并于70年代形成一門晶體學(xué)的分支學(xué)科。X 射線衍射技術(shù)能夠精確測定原子在晶體中的空間位置是迄今研究生物大分子結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)。獲得具有高分辨率的蛋白質(zhì)晶體是目前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的主要瓶頸. 蛋白質(zhì)結(jié)晶受很多因素影響,可以說,蛋白質(zhì)的內(nèi)在特性在某種程度上決定了其能否結(jié)晶以及所得晶體分辨率的高低. 近年來分子生物學(xué)尤其是蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用有效地提高蛋白質(zhì)的溶解度、均一性及可結(jié)晶性等內(nèi)在特性,促進

12、蛋白質(zhì)的結(jié)晶,成為提高蛋白質(zhì)結(jié)晶能力和蛋白質(zhì)晶體分辨率的有效途徑.4.離子通道的理論研究方法 子模擬方法20世紀70年代,生物分子學(xué)實驗技術(shù)的進步,X射線、NMR 等技術(shù)的使用,使得研究生物分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)成為可能。但是研討生物系統(tǒng)的最大難題是生物系統(tǒng)的復(fù)雜性,用牛頓力學(xué)和量子力學(xué)的方法來解釋是遠遠不夠的,一個可行的方法是應(yīng)用計算機進行模擬實驗。 因此，分子模擬方法成為重要手段。分子模擬方法是根據(jù)實際體系,在計算機上進行實驗,通過比較模擬結(jié)果與實際體系的實驗數(shù)據(jù)來檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性,并可檢驗由模型導(dǎo)出的解析理論所作的簡化近似是否成功。分子動力學(xué)模擬成功與否在于勢函數(shù)的選擇。上世紀八十年代以后，研究

13、人員的大量工作便在于尋找與生物大分子適應(yīng)的勢函數(shù)。 分子力學(xué)的方法在研究通道的選擇性上有著獨特的優(yōu)勢，并且可以為布朗動力學(xué)等其他理論方法提供勢能面的計算、擴散系數(shù)、介電常數(shù)等基本條件。4.2離子通道門控機制的理論研究方法大多數(shù)離子通道大部分時間是關(guān)閉的, 在特殊刺激下打開的機率才增加, 這種現(xiàn)象稱為門控。通道蛋白質(zhì)構(gòu)象變化是門控的基礎(chǔ)。在膜片鉗成功的實驗背景下, 從七十年代后期起, 國際上來自不同領(lǐng)域的優(yōu)秀學(xué)者開始著手以通道膜片鉗技術(shù)為基本手段, 建立反映通道門控機制的數(shù)學(xué)模型, 以定量的方式刻劃通道蛋白質(zhì)時而開啟、時而關(guān)閉的動態(tài)特征, 力求通過數(shù)理分析, 在更深層次上認識通道門控的規(guī)律。 馬

14、爾可夫門控模型學(xué)說:Colquhoun 等建立了通道活動的馬爾可夫模型, 認為通道活動表現(xiàn)為少數(shù)種關(guān)閉狀態(tài)和少數(shù)種開放狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)移, 狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)移強度僅僅依賴于當(dāng)前的狀態(tài), 不依賴于處于該狀態(tài)的時間長短。建立模型的基本假設(shè)是：(1) 通道門控動力學(xué)只有少數(shù)離散狀態(tài) (2)狀態(tài)間的轉(zhuǎn)移強度不隨時間改變。在這種情形下, 可以推導(dǎo)出單通道記錄中的開放持續(xù)時間和關(guān)閉持續(xù)時間的概率密度函數(shù)是有限個指數(shù)項的線性組合。但這種模型不能通過觀察實驗記錄將各種開放(關(guān)閉) 狀態(tài)一一識別出來,因此也就無法確定狀態(tài)個數(shù)及其連接方式,這給建立模型造成了很大困難。 分形模型學(xué)說:Liebovitch 等建立的分形模型

15、, 是基于對角膜內(nèi)皮細胞通道實驗資料后發(fā)現(xiàn)的, 并且不同的構(gòu)象間轉(zhuǎn)化的時間歷程表現(xiàn)出自相似的特性, 即在一種時間尺度下測得的通道開放和關(guān)閉歷程與另一種時間尺度下測得的相似, 具有所謂分形特性。建立模型基本假設(shè)是:認為狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)移強度不是常數(shù), 而是依賴于時間t。分形模型以非線形科學(xué)理論闡釋通道門控行為而引人注目,人們也因此對通道蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)產(chǎn)生了新的見解。但此模型也有自身的缺陷，它沒有區(qū)別動力學(xué)狀態(tài)和構(gòu)象狀態(tài) 。細胞膜離子通道門控機制的研究是近年來發(fā)展起來的一個活躍領(lǐng)域。而建立反映通道門控機制動力學(xué)模型以及相關(guān)問題的研究又是這個領(lǐng)域研究的核心課題。其中馬爾可夫模型是在離子通道的門控機制中

16、最常使用的研究方法。4.3離子通道通透性的理論研究方法電壓鉗技術(shù)的發(fā)明使人們能夠精確地測量離子通道的I-V 曲線,但由于缺少離子通道結(jié)構(gòu)方面的信息,在理論研究方面多數(shù)用勢壘模型來解釋測試結(jié)果。 勢壘模型將滲透過程看做離子跨越通道內(nèi)一系列勢壘的跳躍,其參數(shù)實驗數(shù)據(jù)來確定,而不是直接從通道的結(jié)構(gòu)信息得出,這對于研究通道的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系是不合適的。 因此從通道的結(jié)構(gòu)信息來研究離子通道的通透性顯得尤為重要。泊松- 能斯特- 普朗克（ Poisson-Nernst-Planck，PNP）模型 PNP模型是將結(jié)構(gòu)信息包括在內(nèi)的最簡單的方法。它是基于電擴散理論，以基本的物理化學(xué)定律將通道蛋白上的電荷、通道形狀

17、、離子濃度和電勢考慮在內(nèi)，由能斯特-普朗克方程和泊松方程求得離子流密度Jn，計算離子的通透電流。早期模擬離子通道通透性的PNP 模型形式簡單，考慮了通道蛋白上的電荷、通道的實際形狀、離子濃度和通道兩端的電勢差。 但這種方法沒有考慮離子-離子、離子-通道之間的相互作用，并且把通道看做平均場,這對于半徑小于兩個德拜長度(Debye length)的通道是不適用的。因此這種模型的準(zhǔn)確性讓人懷疑。分子動力學(xué)（molecular dynamics，MD）模型1980 年后,人們開始把分子動力學(xué)應(yīng)用于生物系統(tǒng)的模擬,這種模型成為研究生物系統(tǒng)的重要手段。分子動力學(xué)模擬是以牛頓第二定律為基礎(chǔ)，采用多體勢來描述

18、系統(tǒng)中其他粒子對某個粒子的作用。其中勢函數(shù)是分子動力學(xué)模擬的最關(guān)鍵的輸入?yún)?shù)。這種模型在理解通道的選擇性上具有獨特的優(yōu)勢，可以用來計算離子通道的選擇性與通透性，并且發(fā)現(xiàn)計算結(jié)果與試驗符合很好?？梢詾椴祭蕜恿W(xué)等其他理論方法提供勢能面的計算、擴散系數(shù)、介電常數(shù)等基本條件。但這種分子動力學(xué)模擬也有它自身的局限性，它對計算機的計算速度要求很高，并且耗時很長，分析過程也不能考慮電子間的相互作用也不能計算通道的電導(dǎo)率。布朗動力學(xué)（Brownian dynamics，BD）模型1985年Coopet 等在文獻里首次倡導(dǎo)使用布朗動力學(xué)理論研究離子通道的通透特性。布朗動力學(xué)理論是將通透離子看成布朗粒子，作為布

19、朗粒子通透離子在溶液中會受到來自于溶液的粘滯力和來自于噪聲與漲落的隨機力，同時離子還要受到電場力。用朗之萬方程來描述離子通道的動力學(xué)過程。這種模型的獨特優(yōu)勢是可以模擬離子通道的電導(dǎo)率而不需要知道通道的三級結(jié)構(gòu)。但同時布朗動力學(xué)模擬中需要的一些參數(shù)仍要求助于分子動力學(xué)模擬。反應(yīng)速率理論(RRT) 2001 年MacKinnon 小組發(fā)現(xiàn)源自鏈霉菌的鉀離子通道內(nèi)存在鉀離子特定的結(jié)合位點，并用實驗說明離子的通透過程經(jīng)歷了一系列離散的狀態(tài)。反應(yīng)速率理論即隨機躍遷模型，它是通過描述離子在各狀態(tài)間跳躍的動力學(xué)理論，建立不同態(tài)間躍遷的動力學(xué)模型。從離散的觀點出發(fā)的反應(yīng)速率理論為離子通透性的研究提供了一個簡單又直觀的方法。理論更加簡單，圖像更加清晰。但這種理論的待定參數(shù)是以生理學(xué)測得的實驗數(shù)據(jù)來確定，而不是直接從通道的結(jié)構(gòu)信息得出。