蛋白質(zhì)組期末復(fù)習(xí)

1、基因組，Genome，一個(gè)細(xì)胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列，包括全套基因和間隔序列?；蚪M學(xué)（genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門(mén)學(xué)問(wèn)。蛋白質(zhì)組 (proteome)：一個(gè)基因組(genome)內(nèi)所有基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué) (proteomics):研究與基因組相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)組的學(xué)科，是以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象。有三項(xiàng)科學(xué)進(jìn)展促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的誕生，改變了生物學(xué)研究的前景。(1) 在20世紀(jì)90年代，基因、表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST) 和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的發(fā)展；這些生物體的部分或全部序列信息，是非常重要的信息庫(kù)，在許多情況下，我們都可以

2、免費(fèi)獲取，是我們最終從中獲取對(duì)生物體系理解的信息庫(kù)。(2) 引入易于操作的、基于瀏覽的生物信息學(xué)工具；利用這些工具可以從上述數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取信息，現(xiàn)在可以在幾秒鐘內(nèi)從完整的基因組內(nèi)搜索到特定的核酸或蛋白質(zhì)序列，從而可以使得我們通過(guò)電腦檢測(cè)基因和基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能，探索生命科學(xué)的奧妙。(3) 寡核苷酸陣列(microarray)。微陣含有一系列基因?qū)Ｒ恍怨押塑账峄騝DNA序列，這些序列都有特定的方式結(jié)合在一塊玻片或芯片上。我們可以將感興趣的樣品的DNA混合物熒光標(biāo)記后與微陣（列）進(jìn)行雜交，一次可探測(cè)幾千個(gè)基因的表達(dá)，一個(gè)微陣可以代替幾千個(gè)Northern blotting分析，可在做一次North

3、ern blotting的時(shí)間內(nèi)完成。（通過(guò)使用雙色熒光探針）蛋白質(zhì)組學(xué)的研究特點(diǎn)：1. 同一性與多樣性2. 有限與無(wú)限3. 靜態(tài)與動(dòng)態(tài)4. 時(shí)間與空間5. 孤立行為與相互作用6. 單一手段和多種技術(shù)7. 互補(bǔ)與互助1. 同一性與多樣性同一性：在不同發(fā)育階段，在不同種類(lèi)組織或器官的細(xì)胞里，基因組也都是一樣的；多樣性：由于蛋白質(zhì)是生物體生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，因此，對(duì)于不同類(lèi)型的細(xì)胞或同一個(gè)細(xì)胞在不同的活動(dòng)狀態(tài)下，蛋白質(zhì)組的構(gòu)成就不同。2. 有限與無(wú)限有限：對(duì)一個(gè)生物體而言，其基因組中的核苷酸數(shù)量是確定的，無(wú)論是簡(jiǎn)單的生物體，還是復(fù)雜的生物體，都是一樣的。無(wú)限：蛋白質(zhì)的種類(lèi)有多少則很難說(shuō)得清，蛋白

4、質(zhì)組中的的數(shù)量將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組中的基因數(shù)量。，對(duì)于基因組中核酸序列的測(cè)定（基因研究）是有限的，而對(duì)于蛋白質(zhì)組中的蛋白質(zhì)種類(lèi)的確定則是一種相對(duì)“無(wú)限的工作”。3. 靜態(tài)與動(dòng)態(tài)靜態(tài)：一個(gè)生物體從出生到死亡，其基因組幾乎都始終保持不變（凋亡、衰老除外），因而可以認(rèn)為是靜態(tài)的。動(dòng)態(tài)：蛋白質(zhì)組中的蛋白質(zhì)的構(gòu)成也是在不斷地變化著。為便于說(shuō)明，把生命活動(dòng)中的蛋白質(zhì)可大致分為兩類(lèi)： 比較穩(wěn)定的：如負(fù)責(zé)各種結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)； 變 化 的：隨細(xì)胞的生命活動(dòng)和狀態(tài)發(fā)生量或質(zhì)的變化的蛋白質(zhì)，如負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞活動(dòng)調(diào)控的蛋白質(zhì)。4. 時(shí)間與空間基因組：DNA通常位于核內(nèi)，且保持穩(wěn)定，因而我們?cè)跍y(cè)定DNA序列時(shí)是不受時(shí)

5、空影響的。蛋白質(zhì)組：蛋白質(zhì)組研究中，不僅要考慮時(shí)間因素，還需考慮空間因素，這是因?yàn)椋?1) 不同的蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞的不同部位，其功能與空間定位密切相關(guān)；要完全了解蛋白質(zhì)的功能，就必須要知道蛋白質(zhì)所處的空間位置。(2) 許多蛋白質(zhì)在細(xì)胞里不是靜止不動(dòng)的，他們?cè)诩?xì)胞里通常通過(guò)在不同的亞細(xì)胞環(huán)境里的運(yùn)動(dòng)發(fā)揮作用，如在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控也常依賴于蛋白質(zhì)在空間位置的變化和運(yùn)動(dòng)。5. 孤立行為與相互作用孤立行為：在基因組中基因表達(dá)的各種mRNA是彼此孤立的，互不干擾。相互作用：蛋白質(zhì)則正好相反，彼此間存在著廣泛的相互作用，蛋白質(zhì)的功能的實(shí)現(xiàn)離不開(kāi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與其他的生物大分子之間的相互作用

6、，6. 單一手段和多種技術(shù)單一手段: 由于基因組的均一性和簡(jiǎn)單性，使得使用一種單一的技術(shù)（DNA測(cè)序）就能夠勝任基因組研究任務(wù)；多種技術(shù): 在蛋白質(zhì)組研究中，所需技術(shù)就遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止一種，并且技術(shù)難度也遠(yuǎn)大于基因組研究技術(shù)。蛋白質(zhì)組研究技術(shù)可簡(jiǎn)單地分為三大類(lèi)：(1) 蛋白質(zhì)組的分級(jí)分離技術(shù); (2) 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù); (3) 數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)及其分析軟件的使用7. 互補(bǔ)與互助蛋白質(zhì)組學(xué)研究與基因組學(xué)研究互相補(bǔ)充又互相幫助；通過(guò)蛋白質(zhì)組分析，可減低基因注釋中的出錯(cuò)率，推測(cè)和確定ORF的全長(zhǎng)；通過(guò)基因組分析，可預(yù)測(cè)未知蛋白，從而為細(xì)胞功能研究打下基礎(chǔ)；雙雜交技術(shù)、phage-display技術(shù)等是以基因組數(shù)據(jù)

7、和技術(shù)為基礎(chǔ)；在MS測(cè)定蛋白質(zhì)中，離不開(kāi)對(duì)已知基因組中的基因數(shù)據(jù)的比較。蛋白質(zhì)組分析流程蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來(lái)自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和分析。2-DE 技術(shù)是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。雙向凝膠電泳(2D-PAGE)雙向凝膠電泳的基本原理:先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)在 pH 梯度膠內(nèi)進(jìn)行等電聚焦，然后按照它們的相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行 SDS-PAGE 第二次電泳分離。第一向進(jìn)行等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點(diǎn)特性，根據(jù)各自不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個(gè)很窄的p

8、H 梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。第二向是將在 IPG 膠條中經(jīng)過(guò)第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 SDS-PAGE凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量或分子量 (MW) 大小與第一向相垂直的分離。沿垂直的方向進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，按分子量大小進(jìn)行分離。樣品經(jīng)過(guò)電荷和質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后，得到等電點(diǎn)和分子量的信息。樣品制備:基本遵循以下6條原則：(1) 樣品緩沖液中離子濃度的控制；(2) 溶解包括疏水蛋白在內(nèi)的所有蛋白質(zhì)，且制備方法應(yīng)具可重現(xiàn)性；(3) 防止聚焦過(guò)程中已溶解蛋白質(zhì)的聚焦和析出；(4) 防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）；(5) 去除或完全降解核酸及其他干擾分子；(6) 盡

9、量去除高豐度或不相關(guān)的蛋白質(zhì)，提高低豐度蛋白的濃度，使其達(dá)到檢測(cè)要求。樣品的溶解樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一，溶解的目標(biāo)：(1) 樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）；(2) 溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類(lèi)、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；(3) 溶解方法要保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。增加樣品溶解性的手段(1) 變性劑(2) 表面活性劑(3) 還原劑(4) 起載體作用的兩性電解質(zhì)樣品中核酸的去除:對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、

10、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì) (SCA) 同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過(guò)超速離心來(lái)去除復(fù)合物。雙向凝膠電泳技術(shù)流程IPG重泡漲及樣品加樣第一向等電聚焦第二向SDS-PAGE檢測(cè)問(wèn)題及解決辦法質(zhì)譜法 (mass spectrometry, MS)：是在高真空系統(tǒng)中將樣品分子離解成帶電的離子，并通過(guò)對(duì)生成離子的質(zhì)量和強(qiáng)度的測(cè)定，而進(jìn)行樣品成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。 質(zhì)譜學(xué) (mass spectroscopy)：研究質(zhì)譜法及樣品在質(zhì)譜測(cè)定中的電離方式、鑒別規(guī)律以及質(zhì)譜圖特征的科學(xué)稱(chēng)為質(zhì)譜學(xué)。MS系統(tǒng)質(zhì)譜分析

11、方法就是將待測(cè)樣品在離子源中轉(zhuǎn)化為離子，利用離子在電磁場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的性質(zhì)，將其按質(zhì)荷比 (m/e) 大小排列出質(zhì)譜圖，然后通過(guò)對(duì)質(zhì)譜圖的解釋對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析。這樣的分析儀器就稱(chēng)為質(zhì)譜儀。系統(tǒng)：進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)亦稱(chēng)為樣品導(dǎo)入系統(tǒng)，是能把樣品轉(zhuǎn)化成被質(zhì)譜儀分析的裝置。離子源/離子化系統(tǒng)把樣品分子或原子電離成離子（正離子或負(fù)離子，常為正離子），并能將這些離子聚焦成一定幾何形狀和一定能量的離子束的裝置。質(zhì)量分析器 (mass analyzer)質(zhì)量分析器或質(zhì)量分離/分析系統(tǒng)是將離子源加速出來(lái)的不同質(zhì)荷比的離子進(jìn)行單一分離，并實(shí)現(xiàn)同質(zhì)荷比(m/e)離子良好聚焦的裝置。檢測(cè)器/離子檢測(cè)系統(tǒng)其作用是接受、

12、檢測(cè)質(zhì)量分析器分離后的不同m/e比的離子束。有三種不同類(lèi)型的檢測(cè)器。MS的特點(diǎn)：(1) 應(yīng)用范圍廣(2) 靈敏度高，樣品用量少(3) 分析速度快MS用途：(1) 測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量由高分辨質(zhì)譜獲得分子離子峰的質(zhì)量數(shù)，可測(cè)出精確的相對(duì)分子質(zhì)量。(2) 鑒定化合物如果事先可估計(jì)出樣品的結(jié)構(gòu)，用同一裝置、同樣操作條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品及未知樣品，比較其譜圖即可進(jìn)行定性鑒定。(3) 推測(cè)未知物的結(jié)構(gòu)從分子離子和碎片離子獲得的信息可推測(cè)分子結(jié)構(gòu)。(4) 推測(cè)分子中Cl、Br等的原子數(shù)同位素含量比較多的元素(Cl、Br et al.)，可通過(guò)同位素強(qiáng)度及其分布特征推算出這些原子的數(shù)目。(5) 色-質(zhì)聯(lián)用，可用于多

13、組分的定性和定量采用“選擇離子檢測(cè)(selected ion-monitoring, SIM)”技術(shù)可獲得非常高的靈敏度和選擇性，是目前痕量有機(jī)分析最有效的手段之一。質(zhì)譜技術(shù)為什么要遲至20世紀(jì)80年代才進(jìn)入生物大分子領(lǐng)域呢？阻礙質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)入生物大分子領(lǐng)域的主要障礙是當(dāng)時(shí)采用的電子轟擊 (electron impact, EI) 離子化裝置的電離能量太強(qiáng)，而生物大分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且熱不穩(wěn)定，EI不適于生物大分子分析。直到20世紀(jì)80年代，電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)的出現(xiàn)才使質(zhì)譜技術(shù)真正進(jìn)入生物大分子領(lǐng)域，物質(zhì)譜的軟電離方式：電噴霧離子化(electrospray ionizatio

14、n, ESI) ESI是一種軟電離方式，它是在“離子蒸發(fā)”的原理基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種離子化方法。離子蒸發(fā)是指離子從液相發(fā)射到氣相的過(guò)程。待測(cè)分子溶解在溶劑中，以液相方式通過(guò)毛細(xì)管到達(dá)噴口，在噴口高電壓作用下，形成帶電荷的微滴，隨著微滴中的揮發(fā)性溶劑的蒸發(fā)，微滴表面的電荷密度隨半徑減少而增加，當(dāng)達(dá)到某一臨界點(diǎn)后，樣品將以離子方式從液滴表面蒸發(fā)，進(jìn)入氣相，這一過(guò)程即實(shí)現(xiàn)了樣品的離子化。由于沒(méi)有直接的外界能量作用于樣品分子，因而這種方式對(duì)分子結(jié)構(gòu)破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式基質(zhì)輔助激光解吸離子化 (matrix-assisted laser desorption ionization, MA

15、LDI)MALDI是將樣品分子均勻地包埋在固體基質(zhì)中，基質(zhì)吸收激光提供的能量而蒸發(fā)，并攜帶部分樣品分子進(jìn)入氣相，然后將一部分能量傳遞給樣品分子，最后使其離子化。 MALDI的最大特點(diǎn)是：離子電荷通常為1個(gè)或2個(gè)，而不像ESI為多電荷。對(duì)于分子量較大的樣品而言不會(huì)形成復(fù)雜的多電荷圖，因而對(duì)圖譜的解析就比較清楚。 由于MALDI的進(jìn)樣是固相方式，不像ESI的液相進(jìn)樣方式容易受到溶液性質(zhì)的影響，因而對(duì)雜質(zhì)的耐性較好。由于通常在制備生物樣品時(shí)，往往會(huì)在生物樣品中引入一些緩沖液或去垢劑（如尿素、SDS等），這時(shí)采用MALDI會(huì)有較好的結(jié)果。(3) ESI和MALDI的比較 離子化方式可在線聯(lián)用的方式離子

16、電荷形式 對(duì)雜質(zhì)容忍程度ESI 液相 多電荷 直接進(jìn)樣時(shí)差MALDI 固相 一般為1或2個(gè)電荷 較好串聯(lián)質(zhì)譜(tandem MS, MS/MS) 串聯(lián)質(zhì)譜是指將多個(gè)質(zhì)譜分析儀相連，分離母離子進(jìn)行碰撞解離，并檢測(cè)子離子。碰撞誘導(dǎo)解離 (collision induced dissociation, CID) CID僅指離子解離成碎片的過(guò)程。染色法 (1) 傳統(tǒng)染色法考馬斯亮藍(lán)染色（考染）和銀染法?？既镜膬?yōu)點(diǎn)是較靈敏、可以達(dá)g級(jí)檢測(cè)水平、具線性動(dòng)力學(xué)范圍、非常適合定量、易于使用并且與MS兼容性非常好；缺點(diǎn)是g級(jí)檢測(cè)水平使其無(wú)法檢測(cè)一些低豐度蛋白質(zhì)，這也成為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究瓶頸。銀染的優(yōu)點(diǎn)是比考染靈

17、敏約100倍，檢測(cè)限度可達(dá)到ng級(jí)水平，得到廣泛應(yīng)用；缺點(diǎn)是其并非完全符合線性動(dòng)力學(xué)（僅在100150ng范圍內(nèi)符合），從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)差異顯示的準(zhǔn)確性不夠，給后續(xù)分析及鑒定帶來(lái)一定的困難；另外，在實(shí)際操作中使用的Ag及戊二醛影響膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶解，降低了蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的氨基酸序列覆蓋率?，F(xiàn)在發(fā)展了改進(jìn)的無(wú)戊二醛銀染法和H2O2脫色法，提高了銀染成功率，降低了不利因素帶來(lái)的影響。(2) 熒光染色法優(yōu)點(diǎn)：染色多種多樣，靈敏度高（與銀染相同），克服了銀染的一些缺點(diǎn)。染料與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，減少了對(duì)酶解及質(zhì)譜分析的影響，極大地提高了氨基酸的序列覆蓋率，同時(shí)具有較寬廣的線性動(dòng)力學(xué)范圍 (22,000ng)，

18、這使得低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和蛋白質(zhì)的精確定量更為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便。 缺點(diǎn)：需要使用昂貴的儀器、試劑，這延緩了推廣速度。肽質(zhì)量指紋圖譜 (peptide mass fingerprint, PMF) 每個(gè)蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解后成為長(zhǎng)短不一的肽段，同一時(shí)間獲取所有肽段分子質(zhì)量而形成一個(gè)肽段分子質(zhì)量圖譜，這一圖譜對(duì)蛋白質(zhì)反應(yīng)是專(zhuān)一而特異的，因此稱(chēng)為PMF。蛋白質(zhì)定量分析策略當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究中比較成熟和可信的定量策略與方法主要有兩種，一是基于雙向凝膠電泳技術(shù)的染料染色法，二是基于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的化學(xué)標(biāo)記法；不過(guò)，新的研究方法也在不斷涌現(xiàn)，如近年發(fā)展起來(lái)的利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行的無(wú)標(biāo)記定量方法等。不同染色方法的比較表1 不同

19、染色方法的比較染色方法 靈敏度(pg) 線性范圍 與質(zhì)譜兼容性 試劑耗費(fèi) 對(duì)軟硬件要求考馬斯亮藍(lán)染色105 g + + +銀染 200 100-150 ng + + + 熒光染色400 2-2000 ng + + +熒光標(biāo)記250 2-2000 ng + + +化學(xué)標(biāo)記定量法以質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)標(biāo)記定量方法有多種，歸納起來(lái)主要有兩類(lèi)，一種是體內(nèi)標(biāo)記，另一種是體外標(biāo)記。體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞在含穩(wěn)定性同位素的介質(zhì)中生長(zhǎng)，穩(wěn)定性同位素被結(jié)合進(jìn)蛋白質(zhì)，從而充當(dāng)了蛋白質(zhì)定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。15N體內(nèi)代謝標(biāo)記用富含15N的介質(zhì)來(lái)培養(yǎng)酵母、細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，15N被摻入合成的蛋白質(zhì)中，從而充當(dāng)定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，這

20、是一種普遍標(biāo)記的方法。對(duì)必需氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的體內(nèi)標(biāo)記法(SILAC)通過(guò)體內(nèi)標(biāo)記進(jìn)行定量蛋白質(zhì)分析還有一種策略就是在培養(yǎng)介質(zhì)中加入穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的必需氨基酸，這主要用于對(duì)高等動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的定量以及鑒定。體內(nèi)標(biāo)記方法的優(yōu)缺點(diǎn)相對(duì)于體外標(biāo)記，體內(nèi)標(biāo)記方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在：它省去了標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)和分離純化等步驟，減少了樣品的損失，有利于對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)。但是，體內(nèi)標(biāo)記也存在一些缺點(diǎn)，表現(xiàn)在： 它不能對(duì)組織來(lái)源的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析； 培養(yǎng)細(xì)胞在富含穩(wěn)定性同位素的介質(zhì)中生長(zhǎng)，這些介質(zhì)可能會(huì)參與細(xì)胞的繁殖和其他生物進(jìn)程，由此改變蛋白質(zhì)的表達(dá)水平； 這種方法受到同位素材料成

21、本的限制，不太可能對(duì)整個(gè)動(dòng)物體進(jìn)行標(biāo)記； 對(duì)于未知序列的肽段，大多數(shù)的體內(nèi)標(biāo)記方法都無(wú)法確定標(biāo)記物與肽段之間量的關(guān)系，從而使得我們難以確認(rèn)同一肽段在質(zhì)譜圖上成對(duì)出現(xiàn)的不同同位素的標(biāo)記形式。體外標(biāo)記 【-NH2、-COOH、-SH】氨基 (-NH2) 標(biāo)記在肽段的N-端和Lys殘基的側(cè)鏈上都有-NH2基團(tuán)，容易跟含有酰(xin)氧基的分子（如琥珀酸酐、N-乙酰氧琥珀酰亞胺等）發(fā)生?；磻?yīng)，從而對(duì)肽段進(jìn)行標(biāo)記。羧基 (-COOH) 標(biāo)記肽段的C-端和肽鏈上的天冬氨酸 (Asp) 和谷氨酸 (Glu) 殘基側(cè)鏈上的羧基 (-COOH) 也可以用于標(biāo)記，這種標(biāo)記方法主要通過(guò)兩條路線來(lái)完成。巰基 (-

22、SH) 標(biāo)記策略 (ICAT)在組成蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基中，沒(méi)有哪一個(gè)能比半胱氨酸 (Cys) 殘基上的-SH基團(tuán)更具有標(biāo)記反應(yīng)的特異性。ICAT標(biāo)記方法的步驟:1. 將來(lái)自一種狀態(tài)下的細(xì)胞的蛋白質(zhì)混合物分離純化后用D0試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的Cys殘基；將來(lái)自另一狀態(tài)下的同種細(xì)胞的蛋白質(zhì)混合物分離純化后用D8試劑標(biāo)記；2. 將兩種樣品混合在一起，用trypsin酶切，產(chǎn)生多肽片段，包括標(biāo)記的和未標(biāo)記的；3. 樣品經(jīng)SCX-RPLC兩維色譜分離，除去消化酶、去垢劑、還原劑和ICAT試劑；4. 混合物經(jīng)過(guò)抗生物素和色譜柱分離，得到只含有同位素標(biāo)記的多肽混合物；5. 將分離得到的標(biāo)記多肽混合物再用

23、RP-lC-MS分離和鑒定。ICAT策略的優(yōu)點(diǎn):1. 若一種蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生至少一個(gè)Cys殘基的肽段的話，就可以對(duì)其進(jìn)行鑒別和定量。含有Cys殘基的肽段越多，結(jié)果對(duì)照得出的結(jié)論就越準(zhǔn)確；2. 鑒定的肽段中肯定都會(huì)有至少一個(gè)Cys，因此在進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)就增加了一個(gè)有效的約束條件；3. 肽段根據(jù)標(biāo)記情況有選擇性地得到了富集，從而減少了下游質(zhì)譜分析的復(fù)雜程度；4. 分離出來(lái)的標(biāo)記多肽可直接與后面的RP-µLC-MS分析系統(tǒng)在線偶聯(lián)操作；5. 可直接對(duì)混合樣品進(jìn)行分析；6. 可對(duì)低豐度蛋白質(zhì)直接捕獲和快速定性、定量鑒定，尤其是對(duì)膜蛋白等疏水性蛋白質(zhì)；7. 可快速找出功能性蛋白質(zhì)；8. 無(wú)需繁

24、冗的雙向凝膠電泳分析分離；9. ICAT軟件及質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)系統(tǒng)可用于全自動(dòng)快速鑒定蛋白質(zhì)。ICAT策略的缺陷：1. 不能獲得不含Cys的肽段，同時(shí)翻譯后修飾的檢出率較低，而酵母細(xì)胞中約有10%左右的蛋白質(zhì)肽鏈上沒(méi)有Cys殘基，因而得不到鑒定；2. ICAT試劑的分子質(zhì)量為500Da左右，相對(duì)肽段而言較大，增加了數(shù)據(jù)庫(kù)檢索算法的復(fù)雜性，對(duì)于較小片段的修飾可能會(huì)影響數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；3. 耗時(shí)太長(zhǎng)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)消耗在表達(dá)量沒(méi)有改變的蛋白質(zhì)上，而這些蛋白質(zhì)可能與研究的問(wèn)題沒(méi)有太大的關(guān)聯(lián)；4. 相對(duì)于雙向凝膠電泳技術(shù)，該方法有高分子量偏性。ICAT策略的改進(jìn)措施：1. 采用了固相氨基酸同位素標(biāo)記試劑來(lái)代替ICA

25、T試劑；2. 采用多維LC-MS/MS分析系統(tǒng)，把鑒定和定量分開(kāi)；3. 雙向凝膠電泳技術(shù)與ICAT技術(shù)互補(bǔ)結(jié)合測(cè)定蛋白質(zhì)在兩樣品中的相對(duì)含量 4. 磷酸化蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽(Phosphoprotein isotope-coded Affinity Tags, PhIAT) 技術(shù)。體內(nèi)標(biāo)記方法的優(yōu)缺點(diǎn)相對(duì)于體外標(biāo)記，體內(nèi)標(biāo)記方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在：它省去了標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)和分離純化等步驟，減少了樣品的損失，有利于對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)。但是，體內(nèi)標(biāo)記也存在一些缺點(diǎn)，表現(xiàn)在： 它不能對(duì)組織來(lái)源的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析； 培養(yǎng)細(xì)胞在富含穩(wěn)定性同位素的介質(zhì)中生長(zhǎng)，這些介質(zhì)可能會(huì)參與細(xì)胞的繁殖

26、和其他生物進(jìn)程，由此改變蛋白質(zhì)的表達(dá)水平； 這種方法受到同位素材料成本的限制，不太可能對(duì)整個(gè)動(dòng)物體進(jìn)行標(biāo)記； 對(duì)于未知序列的肽段，大多數(shù)的體內(nèi)標(biāo)記方法都無(wú)法確定標(biāo)記物與肽段之間量的關(guān)系，從而使得我們難以確認(rèn)同一肽段在質(zhì)譜圖上成對(duì)出現(xiàn)的不同同位素的標(biāo)記形式。蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片是一種在高密度的方格上含有各種微量純化的蛋白質(zhì)，并能夠高通量地測(cè)定這些蛋白質(zhì)的生物活性，以及蛋白質(zhì)與生物大分子之間的相互作用。蛋白質(zhì)組研究中的翻譯后修飾蛋白質(zhì)磷酸化蛋白質(zhì)可逆磷酸化在調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有重要作用，是細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控中心。磷酸化反應(yīng)是泛指把磷酸基團(tuán)通過(guò)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)移到其它化合物上的過(guò)程。蛋白質(zhì)的磷酸化則是指由

27、蛋白激酶催化的把ATP或GTP 位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的過(guò)程，其逆轉(zhuǎn)過(guò)程是由蛋白磷酸酶催化的，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的脫磷酸化。蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程中的質(zhì)量與結(jié)構(gòu)變化蛋白質(zhì)磷酸化分析的困難（不足或特點(diǎn)）分析蛋白質(zhì)的磷酸化是困難的，盡管現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展非常迅猛，但是磷酸化分析所面臨的難點(diǎn)仍然存在，具體有以下幾點(diǎn)：(1) 磷酸化蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)中是相對(duì)較低豐度的；(2) 即使我們找到一種磷酸化蛋白質(zhì)，也不能排除有該蛋白質(zhì)的其它磷酸化形式存在，在體內(nèi)磷酸化與其像是一座山（靜態(tài)），不如像是一條河（動(dòng)態(tài)）；(3) 細(xì)胞內(nèi)有許多磷酸酯酶，在進(jìn)行樣品處理時(shí)，這些酶很容易將磷酸基團(tuán)脫掉，因而加入磷酸

28、酯酶抑制劑是很必要的；(4) 磷酸化蛋白質(zhì)酶解后的磷酸化肽段，因?yàn)槠浠瘜W(xué)性質(zhì)的負(fù)電性，在質(zhì)譜技術(shù)中面臨著難以質(zhì)子化的困難；(5) 磷酸化肽段在質(zhì)譜圖中還往往受到非磷酸化肽段信號(hào)的強(qiáng)烈抑制，這一點(diǎn)在MALDI質(zhì)譜中尤為明顯。磷酸化蛋白質(zhì)組研究的具體策略如下：磷酸化蛋白質(zhì)的富集策略由于磷酸化蛋白質(zhì)豐度低，而且分析檢測(cè)磷酸化肽段存在困難，使得富集技術(shù)（策略）在磷酸化蛋白質(zhì)組中的研究顯得十分重要、必要。富集的策略應(yīng)用在磷酸化蛋白質(zhì)組研究中，有兩種不同的應(yīng)用階段，包括富集磷酸化蛋白質(zhì)和富集磷酸化肽段。磷酸化蛋白質(zhì)的富集1 磷酸化蛋白質(zhì)抗體這是目前富集磷酸化蛋白質(zhì)的主要手段，而磷酸化蛋白質(zhì)的抗體主要分成兩

29、種：一種是絲氨酸磷酸化蛋白質(zhì)和蘇氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的抗體，另一種是酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的抗體。2 化學(xué)修飾在富集磷酸化蛋白質(zhì)中，也可采用化學(xué)方法進(jìn)行修飾，改變磷酸基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，然后特異性地分離純化，就可以定量地分析這些磷酸化蛋白質(zhì)。 第一種化學(xué)修飾方法該種化學(xué)修飾的基礎(chǔ)是利用磷酸基團(tuán)脫去后的消除反應(yīng)，通過(guò)加減反應(yīng)，共價(jià)連接新的化學(xué)修飾基團(tuán)。這種化學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是：所有的反應(yīng)都在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行，沒(méi)有很多的反應(yīng)步驟，反應(yīng)的產(chǎn)率有一定的保證。但這種方法也有明顯的缺點(diǎn)：就是對(duì)酪氨酸的磷酸化無(wú)能為力。第二種化學(xué)修飾方法是對(duì)第一種方法的合理補(bǔ)充，它可以應(yīng)用于對(duì)酪氨酸磷酸化的修飾。這種方法在保護(hù)肽段的氨基

30、和羧基端的基礎(chǔ)上，對(duì)磷酸基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，然后用具特異性化學(xué)表面的微球進(jìn)行純化。很明顯，這種方法的化學(xué)基礎(chǔ)復(fù)雜，其核心是對(duì)磷酸基團(tuán)的修飾，以便使有特異性化學(xué)表面的玻璃珠結(jié)合純化。該方法的缺點(diǎn)：步驟太多、產(chǎn)率相對(duì)較低。磷酸化肽段的富集策略：固定金屬螯合親和層析在磷酸化蛋白質(zhì)組研究中應(yīng)用的抗體只是對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)有效，對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行富集使用較多是固定金屬螯合親和層析(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)法。磷酸基團(tuán)親和取代將磷酸化肽段上的磷酸基團(tuán)用另一種親和基團(tuán)取代，再用親和提取的方法從混合物中分離富集磷酸肽，是近幾年出現(xiàn)的一種新技術(shù)。主

31、要有兩種取代方式：一種是使磷酸基團(tuán)在堿性條件下發(fā)生-消除反應(yīng)生成雙鍵，再用巰基乙醇通過(guò)加成反應(yīng)取代磷酸基團(tuán)的位置，最后通過(guò)交聯(lián)劑在巰基上連接生物素，并用親和素色譜柱分離，這種方法只適合于磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的取代；另一種是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在磷酸基團(tuán)上連接一個(gè)半胱胺基團(tuán)(cysteamine)，修飾后的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝膠親和提取，這種方法適合對(duì)各種磷酸化氨基酸的取代。這兩種磷酸基團(tuán)的親和取代方法都需要進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，為了避免副反應(yīng)的影響，都需要對(duì)蛋白質(zhì)中的一些活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，整個(gè)反應(yīng)體系比較復(fù)雜。磷酸化蛋白質(zhì)/肽段富集策略的優(yōu)缺點(diǎn)以抗體為基礎(chǔ)的對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的富集策略有效但很昂貴，現(xiàn)階段酪氨

32、酸磷酸化蛋白質(zhì)的抗體比絲氨酸、蘇氨酸的要有效些，對(duì)于大多數(shù)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室而言，也是同樣有效的，但受財(cái)力所限使用困難；而以色譜方法為基礎(chǔ)的對(duì)磷酸化肽段的富集策略(IMAC)，同樣是有效的，甚至于在有化學(xué)修飾輔助下更加有效，而重要的是試驗(yàn)花費(fèi)與前者相比微不足道，因而會(huì)有更好的應(yīng)用前景。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的定量問(wèn)題主要方法：同位素標(biāo)記在磷酸化定量中的應(yīng)用，該方法有2種類(lèi)型。穩(wěn)定性同位素標(biāo)記磷酸化研究的同位素標(biāo)記策略是：在細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入穩(wěn)定性同位素（主要是15N），與在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行比較而得到定量的結(jié)果。這種實(shí)驗(yàn)方法的具體操作是將在兩種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞等量混合，裂解細(xì)胞后分離所感興

33、趣的蛋白質(zhì)，經(jīng)酶解并由質(zhì)譜檢測(cè)分析。這種試驗(yàn)方法的設(shè)計(jì)非常巧妙，讓人發(fā)現(xiàn)同位素標(biāo)記技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生的“化學(xué)反應(yīng)”式的效果，這種方法將蛋白質(zhì)的鑒定與磷酸化的定量同時(shí)完成，而且還可以了解磷酸化的程度，一舉多得。但這種思路也有其缺陷： 15N同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基的獲得有一定的困難； 這種方法只能應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)其他生物樣本有困難，標(biāo)記的效率和均一性也是一個(gè)問(wèn)題； 質(zhì)譜分析前需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，而低豐度蛋白質(zhì)能否實(shí)現(xiàn)有效分離，值得懷疑，以及分離酶解后是否能找到感興趣的磷酸化肽段也并非完全由實(shí)驗(yàn)者的意愿決定。同位素標(biāo)記的親和試劑同位素標(biāo)記的親和試劑與磷酸化肽段在磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，從而給磷酸化肽段

34、加上親和尾部，引入質(zhì)量數(shù)的差異，以便在質(zhì)譜分析時(shí)根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行定量。這種定量思路比前者要直接一些，更重要的是，要想合成實(shí)驗(yàn)所用的PhIAT試劑，這對(duì)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室是有難度的，而購(gòu)買(mǎi)商品化的試劑又比較昂貴。但是從ICAT方法在蛋白質(zhì)組學(xué)中的一般定量的應(yīng)用來(lái)看，PhICAT應(yīng)該有良好的前景。糖基化蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要的加工過(guò)程，它是指蛋白質(zhì)與葡萄糖（醛基糖）之間發(fā)生的非酶反應(yīng)而生成糖化蛋白的過(guò)程，即指在肽鏈生物合成的同時(shí)或合成后在酶的催化下糖鏈被接到肽鏈上的特定糖基化位點(diǎn)的過(guò)程。蛋白質(zhì)糖基化研究的基本目標(biāo)是： 尋找編碼糖蛋白的基因，即基因組信號(hào)； 尋找糖基化位點(diǎn)，即糖基化位點(diǎn)信息； 解析糖鏈及糖基化肽段的結(jié)構(gòu)，即結(jié)構(gòu)信息； 研究糖基化的功能，即功能信息。生物信息流糖基化蛋白質(zhì)研究的必要性(1) 蛋白質(zhì)糖基化存在于細(xì)胞生命活動(dòng)的各個(gè)方面(2) 糖基化蛋白質(zhì)在病理中的作用由于糖在HIV或其它致病源與血細(xì)胞結(jié)合過(guò)程中扮演重要的角色，它成為免疫與控制和治療癌癥的最主要的線索之一。(3) 多樣性具有足夠多的多樣性是作為任何信息分子的基礎(chǔ)，而糖鏈比核酸和蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上更具有可變性。(4) 在分子進(jìn)化中的作用聚糖中許多令人感興趣的方面可能反映了生物與它們的分子的進(jìn)化作用。如 多糖中少數(shù)穩(wěn)定構(gòu)成單位的自然選擇； 甲醛聚糖反