針對(duì)HBVx基因的siRNA重組腺病毒的制備及其對(duì)HBVx基因表達(dá)的抑制作用

1、針對(duì)HBVx基因的siRNA重組腺病毒的制備及其對(duì)HBVx基因表達(dá)的抑制作用                 作者：秦?zé)槦?，劉家云，張瑞，王濤，王凱，孟艷玲，楊安鋼【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；,RNA干擾；,腺病毒；,基因治療Preparation of recombinant adenovirus mediated siRNA targeting HBVx gene and its suppressive effect on HBVx

2、gene expression【Abstract】 AIM: To construct the recombinant adenovirus vectors for siRNA targeting HBVx gene （HBx） and to evaluate the inhibitive effect on the expression of HBx gene in human hepatoma HepG2 cell line. METHODS: The shuttle vector pShuttleHBx was cotransfected into E. coli BJ5183 with

3、 adenovirus backbone plasmid. The homologous recombinants were transfected into HEK293 packaging cells and adenovirus was packaged and amplified, followed by infection of the HepG2 cells transfected with HBx gene. The expression levels of HBx were determined by RTPCR and Western Blot after the total

4、 RNA and protein were collected. RESULTS: The recombinant adenoviral vectors containing siRNA targeting HBx gene were successfully constructed, which were confirmed by restriction enzyme digestion. RTPCR results demonstrated that the HBx mRNA was markedly decreased and Western Blot results showed th

5、at the expression of HBx protein was also significantly reduced in HepG2 cell line. CONCLUSION: Adenovirusbased siRNA targeting HBx gene can inhibit HBx expression with great potency and specificity in vitro.【Keywords】 hepatitis B virus; RNA interference; aden提針對(duì)HBVx基因的siRNA重組腺病毒的制備及其對(duì)HBVx基因表達(dá)的抑制作用

6、ovirus; gene therapy【摘要】 目的：構(gòu)建針對(duì)乙型肝炎病毒x基因（HBx基因）的小干擾RNA (siRNA)重組腺病毒表達(dá)載體，并在能表達(dá)HBx基因的人肝癌細(xì)胞株HepG2中觀察其對(duì)HBx基因表達(dá)的抑制作用. 方法：重組腺病毒穿梭載體pShuttleHBx與骨架載體在大腸桿菌BJ5183中同源重組得到重組腺病毒載體，后者轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝并擴(kuò)增出病毒顆粒. 用獲得的病毒感染能表達(dá)HBx基因人肝癌細(xì)胞株HepG2，收集細(xì)胞總RNA和總蛋白，采用RTPCR和Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中HBx基因表達(dá)的變化. 結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，證實(shí)針對(duì)HBx基因的si

7、RNA重組腺病毒載體構(gòu)建成功. RTPCR和Western Blot方法證實(shí)，在HepG2細(xì)胞中，HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低. 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的針對(duì)HBx基因的siRNA在體外能夠高效、特異地抑制HBx基因的表達(dá).【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；RNA干擾；腺病毒；基因治療0引言乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因組中，HBx基因編碼的HBX蛋白是HBV編碼蛋白中唯一具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)1-2，可以激活宿主細(xì)胞中受損DNA的修復(fù)3-4，并且同多種腫瘤相關(guān)分子有相互作用. 因此認(rèn)為，HBX與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān). RNA干擾(RNA inte

8、rference, RNAi)是雙鏈RNA (doublestrand RNA, dsRNA)介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）現(xiàn)象，其主要生物學(xué)功能在于抵抗病毒感染，維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性，清除異常RNA，并參與基因表達(dá)的調(diào)控5-6. 我們構(gòu)建針對(duì)HBx基因重組腺病毒干涉載體，在人肝癌細(xì)胞株HepG2中檢測(cè)其對(duì)HBx基因表達(dá)的抑制效果，為乙型肝炎病毒感染以及感染后發(fā)生的肝細(xì)胞肝癌的基因治療提供新思路.1材料和方法含有針對(duì)HBx基因的兩個(gè)干涉靶序列的干涉表達(dá)質(zhì)粒pSUPERHBx2，pSUPERHBx5（干涉

9、序列分別針對(duì)HBx基因的301319位和198216位），表達(dá)HBx基因的質(zhì)粒pCNDA3.1HBxmyc，對(duì)照載體AdeasyH1，pCDNA3EGFP，大腸埃希菌DH5，HEK293細(xì)胞以及人肝癌細(xì)胞HepG2（第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室）. pAdeasy1腺病毒重組系統(tǒng)（Stratgene公司）；限制性內(nèi)切酶Xba I，Hind III和T4 DNA連接酶（ TaKaRa公司）；限制性內(nèi)切酶Pac I和Pme I（New England Biolab公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒（合肥優(yōu)晶生物技術(shù)有限公司）；HDMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone

10、公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；LipofectAmineTM2000，RTPCR試劑盒和TRIZOLTM試劑（Invitrogen公司）； myc標(biāo)簽, EGFP多克隆抗體（Santa Cruz公司）；兔抗人actin多克隆抗體和辣根酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗（武漢博士德公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為（Pierce公司）. 用于擴(kuò)增HBx基因的上游引物：5TTTAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCC3，下游引物：5TTTGGTACCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC3；用于擴(kuò)增內(nèi)參照actin基因的上游引物: 5TGCGCAGAAAACAAGATGAGA

11、TT3, 下游引物: 5TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3；用于擴(kuò)增EGFP基因的上游引物：5ATGCCAGCGGGGACAGCAGC3， 下游引物：5GGTGTCTCCTGGTCTCTTCC3,上述引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成.1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5載體的構(gòu)建經(jīng)Xba I和Hind III雙酶切反應(yīng)，從pSUPERHBx2，pSUPERHBx5質(zhì)粒獲取RNAi表達(dá)框片斷HBx2和HBx5（大小300 bp左右），將兩目的片斷回收后亞克隆入同樣經(jīng)Xba I和Hind III雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle，卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩

12、選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，用Xba I和Hind III雙酶切，10 mL/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定. 獲得含小干擾RNA (short interfering RNA, siRNA)表達(dá)框的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttl 針對(duì)HBVx基因的siRNA重組腺病毒的制備及其對(duì)HBVx基因表達(dá)的抑制作用(2) eHBx2和pShuttleHBx5.1.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5載體的構(gòu)建將pShuttleHBx2，pShuttleHBx5質(zhì)粒用Pme I酶切線性化，與pAdeasy1按101的比例電轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)細(xì)菌. 卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，挑取較小的克隆擴(kuò)增

13、培養(yǎng)，提取質(zhì)粒. 用Pme I酶切鑒定質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增陽(yáng)性克隆并大量提取質(zhì)粒，得到含針對(duì)HBx干涉表達(dá)框的重組腺病毒質(zhì)粒. （陰性對(duì)照質(zhì)粒AdeasyH1為帶有H1啟動(dòng)子的pAdShuttle質(zhì)粒，用Pme I酶切線性化后與pAdeasy同源重組得到）.包裝細(xì)胞培養(yǎng)：含100 mL/L胎牛血清的HDMEM培養(yǎng)基，37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%80%時(shí)轉(zhuǎn)染. 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞：重組質(zhì)粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用Pac I酶切線性化后回收，按照LipofectAmineT

14、M2000說明書轉(zhuǎn)染6孔培養(yǎng)板中的HEK293細(xì)胞，37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，1012 d后收集細(xì)胞，液氮與37 兩個(gè)溫度下反復(fù)凍融4次，裂解細(xì)胞以收獲原始病毒，病毒感染HEK293細(xì)胞使病毒大量擴(kuò)增. 重復(fù)上述步驟，最終收集3輪擴(kuò)增的病毒液，分裝保存于-70. 病毒滴度的測(cè)定：用 TCID法檢測(cè)病毒滴度后，得到1×1010 pfu/mL的病毒工作液.重組腺病毒對(duì)HBx基因mRNA的降解作用制備的重組腺病毒感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，同時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)HBx基因的質(zhì)粒pCNDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP，后者用來監(jiān)測(cè)各組轉(zhuǎn)染效率，對(duì)照組轉(zhuǎn)染只含有H1啟動(dòng)子的質(zhì)

15、粒AdeasyH1. 37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，48 h后，分別收集細(xì)胞總RNA和蛋白. 通過RTPCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞HBx轉(zhuǎn)錄水平的變化：提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HepG2細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，取5 g總RNA按照SuperScriptTM 說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成 ，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板在PE2400型DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng). HBx PCR條件為：95變性5 min，再95 30 s，5      7 30 s，72 30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72延伸5 min. 反應(yīng)產(chǎn)物為HBx基因片段

16、，長(zhǎng)度為464 bp；內(nèi)參照actin基因擴(kuò)增條件為：95變性3 min后，95 30 s，55 30 s，72 45 s，共20個(gè)循環(huán)，最后72延伸5 min，擴(kuò)增片斷大小為438 bp；EGFP基因PCR反應(yīng)參數(shù)為：95變性5 min，再95 30 s，58 45 s，72 30 s，共27個(gè)循環(huán)，最后72延伸5 min，反應(yīng)產(chǎn)物為538 bp. 10 mL/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，比較干涉組與對(duì)照組mRNA水平表達(dá)差異.1.2.5Western Blot檢測(cè)重組腺病毒對(duì)HBX蛋白表達(dá)的影響用100 L的細(xì)胞裂解液裂解上述各組細(xì)胞，4 10 000 g離心20 min，收集上清液，加入等量2

17、×SDS Loading Buffer， 煮沸5 min, 每孔上樣30 L， 蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE分離后， 電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上. 依次加入5 g/L脫脂奶粉（室溫封閉2 h）， 1200 myc標(biāo)簽抗體和EGFP抗體（室溫孵育2 h）， 12000的HRP酶標(biāo)羊抗兔二抗（室溫孵育1 h）. 用TBST緩沖液洗滌后，加入底物發(fā)光劑ECL 1 mL，反應(yīng)5 min后吸干發(fā)光劑，用單層透明薄膜包裹后曝光,X光膠片顯影.2結(jié)果2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5載體的鑒定用Xba I和Hind III雙酶切構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleHBx2和pShut

18、tleHBx5，得到6300 bp及300 bp左右的片斷（圖1），與預(yù)期大小一致,證明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5載體的鑒定用Pme I分別酶切重組質(zhì)粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5，得到23 000 bp和4300 bp兩個(gè)片斷（圖2），結(jié)果與預(yù)期一致，證明骨架質(zhì)粒同源重組成功.pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5腺病毒的包裝含重組腺病毒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293，培養(yǎng)1 wk后，顯微鏡下可見特征性圓球狀及葡萄串樣聚合的細(xì)胞病理性改變；電鏡下可見病毒感染后的死細(xì)胞，胞體腫脹，胞膜不完整，細(xì)胞內(nèi)充滿病毒顆粒（圖3A，圖中

19、箭頭所示即為病毒顆粒）, 以及感染細(xì)胞的胞核，內(nèi)有成堆的病毒顆粒（圖3B，圖中箭頭所示為病毒顆粒）. 第10日，可見大部分包裝細(xì)胞腫脹脫落，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病理反應(yīng)（cytopathological ( 針對(duì)HBVx基因的siRNA重組腺病毒的制備及其對(duì)HBVx基因表達(dá)的抑制作用(3) ) effect，CPE）樣變化.A： 病毒感染的包裝細(xì)胞 ×4000； B： 包裝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的病毒顆粒 ×40 000.包裝完成的病毒顆粒以30 MOI感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，48 h后，分別收集細(xì)胞總RNA和蛋白，檢測(cè)其變化. RTPCR結(jié)果表明，與未處理組和轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞相比，感染腺

20、病毒組細(xì)胞的HBx基因mRNA量明顯降低（圖4A）；Western Blot結(jié)果顯示，感染腺病毒可使細(xì)胞HBX蛋白的表達(dá)量顯著減少（圖4B）.3討論目前，在我國(guó)廣泛應(yīng)用的抗HBV藥物主要有兩類，即干擾素和核苷類藥物如拉米夫定等. 但療效均不理想，新型有效的抗HBV藥物仍在探索中. RNAi用于HBV治療在理論上具有以下優(yōu)點(diǎn)7：特異性降解HBV mRNA，從而阻止病毒復(fù)制，對(duì)已整合入宿主細(xì)胞基因組的前病毒及無復(fù)制活性的病毒，RNAi也可以起到有效的抑制作用，這是通常抗病毒藥無可比擬的. 其次，RNAi可以針對(duì)病毒基因保守區(qū)發(fā)揮作用，從而限制病毒產(chǎn)生逃避突變株的能力. 因而，RNAi技術(shù)為各類慢性

21、HBV感染開辟了新的途徑. 有學(xué)者認(rèn)為RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗HBV治療，有望成為治療乙型肝炎的革命性新方法，將有巨大的社會(huì)價(jià)值8. 腺病毒載體是目前基因治療研究和臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一. 由于腺病毒載體宿主范圍廣，感染效率高，可插入外源基因片段大，可介導(dǎo)外源基因短時(shí)呈高水平表達(dá)和不整合到感染細(xì)胞的基因組中等特點(diǎn)9.在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用He等10創(chuàng)建的pAdeasy腺病毒載體系統(tǒng)，通過細(xì)菌體內(nèi)同源重組的方法，構(gòu)建針對(duì)HBVx基因的兩個(gè)不同位點(diǎn)的siRNA重組腺病毒載體. 該方法不但發(fā)揮了重組腺病毒高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，還具有重組效率高，包裝時(shí)間短等特點(diǎn). 腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾克

22、服了以往用質(zhì)粒作為siRNA輸送載體轉(zhuǎn)染效率低的缺陷.實(shí)驗(yàn)中我們使用RTPCR, Western Blot的方法在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平證實(shí)針對(duì)HBx基因的siRNA重組腺病毒有效地 (此 資 料 轉(zhuǎn) 貼 于 ) 抑制了HBx基因的表達(dá).本實(shí)驗(yàn)表明腺病毒是一種有應(yīng)用前景的抗HBV感染的基因治療載體， 其可為慢性HBV感染以及HBV感染后發(fā)生的肝細(xì)胞肝癌的基因治療提供新思路.【參考文獻(xiàn)】1Birrer RB,Birrer D,Klavins JV,et al.Hepatocellular carcinoma and hepatitis virus J. Ann Clin Lab Sci,200

23、3,33(1):39-54.2Hwang GY,Lin CY,Huang LM,et al.Detection of the hepatitis B virus X protein(HBX) antigen and antiHBX antibodies in cases of human hepatocellular carcinomaJ. J Clin Microbiol,2003, 11(12): 5598-5603.3Tang H, Delgermaa L, Huang F, et al. The transcriptional transactivation function of HBx protein is important for its augmentation role in hepatitis B virus replicationJ. J Virol, 2005,79(9): 5548-5556.4彭紹華,厲浩,鄧紅,等.HBx蛋白和p53蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)及其在肝細(xì)胞癌發(fā)生中的作用J.腫瘤防治雜志,2003, 10（8）: 792-794.5Novina CD,Sharp PA