肝癌細(xì)胞受照后代生長特性及放射敏感性變化

1、肝癌細(xì)胞受照后代生長特性及放射敏感性變化±±1.5）%，SF2±0.05。HepG2照射后存活后代群體倍增時(shí)間為（124.8 ±±0.6）%（t=8.537, P0.01），SF2±0.08（t=3.811, P0.05），p53表達(dá)水平無差別（t=0.778, P0.05）。結(jié)論 肝癌細(xì)胞照射后存活后代生長延緩，放射敏感性降低，但與p53的表達(dá)無關(guān)。Radiosensitivity and growth characteristics of filial generation from irradiated hepatocarcin

2、oma cellsSHI WeiminCHEN Longhua（Department of Radiation Oncology, Nanfang Hospital,First Military Medical University, Guangzhou 510515,China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the change of radiosensitivity and growth features of the surviving progeny from the irradiated hepatocarcinoma cells. Method

3、sTo cultured human hepatocarcinoma cellsHepG2 and the progeny of irradiated HepG2, plating efficiency(PE), population doubling time(PDT),radiosensitivity index SF2±±1.5)%，SF2±0.06.The PDT of the filial cells was (124.8 ±±0.6)%（t=8.537, P0.01），SF2±0.08（t=3.811, P0.05）. T

4、here was no statistical difference in the expression level of p53 between HepG2 and its progeny（t=0.778, P0.05）.Conclusions In the present study,growth delay and declined radiosensitivity are confirmed in the progeny of irradiated hepatocarcinoma cells while these changes are not correlated to the p

5、53 expression.【Key words】HepG2 cell line;Radiosensitivity;p53肝癌細(xì)胞對放射線有相當(dāng)?shù)拿舾行裕伟┓派渲委熀蟪埩舨≡?。放射治療后?fù)發(fā)的肝癌細(xì)胞的放射敏感性目前并不清楚，本研究擬應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)方法初步評(píng)價(jià)肝癌細(xì)胞照射后存活后代放射敏感性的變化，旨在為臨床放射治療提供參考資料。1材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞株HepG2為本院消化研究所保存。HepG2照射后存活后代為HepG2經(jīng)2Gy照射后存活細(xì)胞傳代15代的細(xì)胞。所有細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI 1640（GIBCO）培養(yǎng)基中，37，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞群體倍增時(shí)間（p

6、opulation doubling time,PDT）：指數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量濃度為2.5g/L胰蛋白酶消化成單細(xì)胞后，1×105個(gè)細(xì)胞接種于直徑6cm培養(yǎng)皿中，分別于培養(yǎng)48，72，96，120，144h時(shí)消化，計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)，繪制細(xì)胞指數(shù)生長曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)：處于指數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量濃度為2.5g/L 胰蛋白酶消化后，按照射劑量將102105個(gè)細(xì)胞接種于直徑3cm培養(yǎng)皿中，分別給予010Gy單劑量照射，培養(yǎng)1214 d后終止培養(yǎng)，甲醇固定，Giemsa染色，鏡下計(jì)數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆，計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF）。每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣品，實(shí)

7、驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)。以線性二次方程S=e?-(D+D2)及多靶單擊模型S=1-(1-e-KD)N擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算細(xì)胞敏感性參數(shù)，SF2，D0，N。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平：細(xì)胞p53蛋白的流式細(xì)胞儀檢測按Ribeiro的方法1。即：細(xì)胞生長至60%匯聚時(shí)用胰蛋白酶或EDTA消化，PBS漂洗后重懸于1mL預(yù)冷的PBS中，用體積份數(shù)為0.70甲醇固定。每份樣品5×105個(gè)細(xì)胞與1g/mL一抗（鼠抗人p53蛋白，國產(chǎn)）在冰上共同孵育1h,PBS漂洗2次，與FITC標(biāo)記的二抗（羊抗鼠IgG，國產(chǎn)）于冰上共同孵育30min, 最后PBS漂洗2次，流式細(xì)胞儀（Epics Eli

8、te，Couter Corporation,USA)檢測熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞抗原表達(dá)強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)方法：用SPSS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，細(xì)胞指數(shù)生長及細(xì)胞存活曲線用平方回歸擬合，各組細(xì)胞參數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s，兩組間比較用t檢驗(yàn)。2結(jié)果±±0.6）%，t=8.537, P0.01。照射后存活后代的細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長：細(xì)胞生長曲線見圖1。HepG2的PDT為（96.0 ±6.8）h,照射后存活后代PDT為（124.8 ±12.2）h，t=3.572, P0.05。 圖1HepG2及受照后代細(xì)胞生長曲線照射后存活后代的放射敏感性降低：細(xì)胞存活曲線

9、見圖2。HepG2的-1，D0為0.42 Gy，N為2.45， SF2±0.05。 照射后存活后代的-1，D0為0.58 Gy，N為1.04，SF2±0.08，t=3.811, P0.05。照射后存活后代p53蛋白表達(dá)水平無變化：p53蛋白的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖3。HepG2的p53陽性率為（37±11）%，照射后存活后代的p53陽性率為（45±14）%，t=0.778,P0.05。圖2HepG2及照后代細(xì)胞存活曲線 圖3HepG2及受照后代細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果3討論目前已有大量研究表明，放射可以誘發(fā)細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，其表現(xiàn)形式多

10、樣，并且可以隨細(xì)胞分裂而傳遞下去，在其存活后代中出現(xiàn)延遲表達(dá)。但細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性是否會(huì)導(dǎo)致其存活后代的放射敏感性的變化呢？Crompton等2用6Gy的X射線照射C3H鼠纖維母細(xì)胞，分析其存活后代的DNA含量和放射敏感性，發(fā)現(xiàn)其存活后代的DNA出現(xiàn)較多的非整倍體，但其放射敏感性卻沒有變化。而Pelevina等3用HeLa和中國倉鼠細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞照射后存活后代放射敏感性增高。然而更多的學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞受射線或其他的DNA 損傷劑作用后，其后代會(huì)產(chǎn)生抗性，即“adaptive response”4，5。不同的實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論不同，可能是由于各實(shí)驗(yàn)用的射線劑量和放射敏感性的評(píng)價(jià)方法有所差異，

11、也可能不同的細(xì)胞對射線的反應(yīng)就存在如此的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞經(jīng)2Gy照射后其后代生長特性改變，克隆形成率降低，生長延緩，并且放射敏感性降低。照射后存活細(xì)胞后代放射敏感性降低的機(jī)制尚不清楚，目前存在兩種假設(shè)：一種認(rèn)為同一細(xì)胞群存在著放射敏感性不同的亞群，照射選擇性地殺滅了敏感亞群，存活的后代是放射抗拒的亞群，因此放射敏感性降低；另一種認(rèn)為細(xì)胞群受照射后存活后代細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)（substructure）發(fā)生了變化，即射線誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了針對DNA損傷的更強(qiáng)的修復(fù)能力，因此面對再次射線作用時(shí)表現(xiàn)為抗性增加，敏感性下降6。本研究難以討論后一種假設(shè)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯然支持和補(bǔ)充了“亞群說”。受照射的

12、肝癌細(xì)胞后代克隆源性細(xì)胞減少，因而克隆形成率降低，倍增時(shí)間延長，指數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)入放射敏感的G2期的比例降低，因此放射敏感性下降。p53作為細(xì)胞周期調(diào)控的一個(gè)重要元件，已知它的表達(dá)與細(xì)胞的放射敏感性密切相關(guān)。Chang等7研究表明細(xì)胞受照射后代p53的表達(dá)無變化，本研究結(jié)果與其相似。由于HepG2細(xì)胞具有野生型p538，其受照射后存活的后代盡管放射敏感性下降，但p53的表達(dá)水平與HepG2相同，說明照射后存活后代放射敏感性的變化與p53表達(dá)無關(guān)。參考文獻(xiàn)1，Ribeiro JCC, Barnetson AR, Fisher RJ,et al.Relationship between radi

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