RGS1對RAW264.7細胞共刺激分子和細胞因子表達的調(diào)節(jié)

1、        【摘要】  目的: 研究RGS1基因?qū)毎砻娣肿颖磉_以及細胞因子分泌的影響。方法: 通過克隆RGS1基因、 轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞、 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系, 利用流式細胞術(shù)檢測, 基因芯片分析初步探討RGS1基因的功能。結(jié)果: RGS1基因能夠抑制NFB轉(zhuǎn)錄因子活性; RGS1基因明顯增加RAW264.7細胞表面CD86分子的表達, 降低CD80表達; 在不同Toll樣受體配體刺激后, CD40、 CD80和PD1水平低于對照組。同時, RGS1基因使IL6、 IL15的表達明顯升高,

2、 IL10、 IL1的表達明顯降低。結(jié)論: RGS1基因可調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細胞表面分子和細胞因子的分泌, 影響Toll 樣受體信號通路,表明RGS1可能在免疫調(diào)節(jié)方面起重要作用。 【關(guān)鍵詞】  免疫調(diào)節(jié) RGS1基因 免疫相關(guān)細胞免疫細胞表面刺激分子和由此產(chǎn)生的細胞因子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用, 對腫瘤免疫, 移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生、 、 轉(zhuǎn)歸有著重要的影響。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)免細胞中有多種基因表達的改變1。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)卵巢腫瘤細胞能夠?qū)е驴乖岢始毎鸕GS1上調(diào), 提示了RGS1可能在免疫調(diào)節(jié)過程中起作用。RGS1（regulator of G protein）是GTPa

3、se激活蛋白, 由許多成員組成。這個家族的成員能在免疫細胞如T細胞、 B細胞和樹突細胞表達。有研究表明, RGS1基因與趨化因子誘導(dǎo)的免疫細胞遷移有關(guān), 從而對免疫功能進行調(diào)節(jié)2。我們通過建立RGS1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞系, 觀察其對細胞表面分子表達的影響和細胞因子分泌模式的改變外, 為RGS1在免疫相關(guān)疾病的潛在應(yīng)用提供實驗依據(jù)。1  材料和方法1.1  材料  RAW264.7細胞購自美國ATCC公司。NFB熒光素酶質(zhì)粒和NFB堿性磷酸酶(seap)質(zhì)粒由美國約翰霍普金斯大學(xué)免疫實驗室贈與; 鼠RGS1pcDNA 3.1/V5質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建;

4、 pcDNA3.1/V5His TOPOTA Expression試劑盒購自Invitrogen公司; PCR緩沖液、 dNTPs、 Taq、 Agarose Gel DNA 純化試劑盒購自TaKaRa公司。LipofectaminTM2000, SuperScript. OneStep RTPCR with PlatinumTaq購自Invitrogen公司。RNA TRIzol 試劑購自北京鼎國公司。Great EscAPeTM SEAP 購自Clontech 公司。TritonX100, 羊抗鼠抗體為Sigma公司產(chǎn)品。Trypsin 胰酶（Lot: AMG 16843）為HyClone

5、公司產(chǎn)品。OPTIMEMI 無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司。PRMI1640 購自HyClone公司。類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自蘭州民海生物公司。G418硫酸鹽, 硫酸卡那霉素購自Amresco公司。1.2  方法1.2.1  克隆RGS1基因測序并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞系  按照Invitrogen公司提供步驟,從腫瘤相關(guān)樹突狀細胞擴增提取RGS1基因片段并克隆到pcDNA 3.1 His/V5 Topo 載體, 測序確定RGS1基因。RPMI1640培養(yǎng)基加入100 mL/L新生牛血清培養(yǎng)RAW264.7細胞。取4×105細胞加入24孔

6、板培養(yǎng)過夜。1 g 鼠RGS1pcDNA 3.1/V5質(zhì)粒溶于50 L OPTIMEM培養(yǎng)基, 顛倒混勻。2  L Invitrogen LipofectaminTM2000溶于50 L OPTIMEM培養(yǎng)基, 顛倒混勻后室溫孵育5 min。混合DNA溶液與LipofectaminTM2000溶液, 顛倒混勻后室溫孵育20 min。吸出24孔板中培養(yǎng)基, 加入100  L混合溶液培養(yǎng)8 h。加入500 L含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。用400 mg/L 濃度的 G418和 100 mL/L血清培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)15 d。1.2.2  檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系轉(zhuǎn)染率 

7、取4×105穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞于流式染色管中1 600 r/min 離心5 min, 棄上清, 加入2 mL PBS 1 600 r/min離心5 min, 棄上清, 用1 mL (1 g/L)多聚甲醛固定細胞。加入2 mL PBS 1 600 r/min離心5 min, 棄上清。加入TritonX100 室溫靜置5 min, 加入2 mL PBS 1 600 r/min離心5 min, 棄上清。染色: 2 mL PBS 1 600 r/min, 離心5 min, 棄上清后加入100 L PBS吹散細胞,用1 g/L多聚甲醛固定, 然后1 g/L Triton 穿透, 加入1 L FITC

8、標(biāo)記的antiV5抗體, 避光放置15 min。加入2 mL PBS 1 600 r/min離心5 min后棄上清, 加入100 L PBS吹散細胞,  取50 L滴于載玻片上, 熒光顯微鏡觀察。1.2.3  RGS1基因?qū)D(zhuǎn)錄因素活性的影響  NFBseap質(zhì)粒與RGS1基因共轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞, 通過化學(xué)發(fā)光方法檢測RGS1基因?qū)D(zhuǎn)錄因素NFB活性的影響。準(zhǔn)備細胞: 100 mL/L 新生牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞, 細胞計數(shù)后按每孔4×105細胞鋪入24孔板, 加入1 mL培養(yǎng)基（不含抗生素）培養(yǎng)過夜。 按照Invitrog

9、en LipofectaminTM2000使用說明書方法共轉(zhuǎn)染RGS1基因及NFBseap質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染36 h后每孔收集110 L細胞上清液于0.5 mL 微量離心管中, 12 000 g離心10 s, 去除細胞沉淀, 吸取100  L上清液于新0.5 mL微量離心管, -20保存。通過化學(xué)發(fā)光強度檢驗（Clontech Great EscAPeTM SEAP）,利用化學(xué)發(fā)光分析儀檢驗化學(xué)發(fā)光強度, 并處理數(shù)據(jù)。1.2.4  FCM檢測RGS1基因?qū)γ庖呦嚓P(guān)細胞RAW264.7表面分子表達水平的影響  培養(yǎng)RGS1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞及未轉(zhuǎn)染的RAW2

10、64.7細胞（對照）,實驗組與對照組分別用不同的Toll 樣受體配體脂多糖（LPS）, Poly I: C, 肽聚糖（peptioglycan, PGN）, 細菌 DNA （BDNA）刺激48 h后, 細胞計數(shù)后取1×107細胞與15 mL離心管中, 1 600 r/min離心5 min, 加入5 mL PBS沖洗后, 1 600 r/min離心5 min, 棄上清。離心管中加入700 L PBS緩沖液, 平均分入7個預(yù)先標(biāo)記好的流式管中, 加入相應(yīng)抗體后, 避光放置15 min。每管加入2 mL PBS, 1 600 r/min離心5 min, 洗去未結(jié)合抗體, 1 g/L多聚甲醛

11、固定。FACSCalibur流式細胞儀測定熒光強度, 并用FACSort流式細胞儀Cell Quest軟件分析實驗結(jié)果。1.2.5  RGS1基因?qū)γ庖呦嚓P(guān)細胞RAW264.7細胞因子表達水平的影響  分別培養(yǎng)1×107 RGS1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞及未轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞（對照）。倒出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基, 5 mL PBS沖洗1次。加入1 mL TRIzol溶液, 消化細胞5 min, 轉(zhuǎn)入2 mL微量離心管中。離心管中加入1 mL氯仿, 充分顛倒混勻, 冰上放置15 min, 4 12 000 g離心15 min, 分離RNA、 DNA與蛋白

12、。小心吸取上層清亮溶液至新的2 mL微量離心管中, 加入0.5 mL異丙醇冰上放置30 min, 沉淀RNA, 4 12 000 g離心15 min。小心倒出上清, 離心管中加入1 mL酒精沖洗沉淀, 4  8 000 g離心5 min。小心倒出上清, 室溫放置15 min, 充分揮發(fā)殘余酒精, 加入50 L去RNA酶蒸餾水溶解沉淀。取10 L溶液用于基因芯片分析（美國約翰霍普金斯大學(xué)）, 剩余溶液-20保存。2  結(jié)果2.1  穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系建立  我們從腫瘤相關(guān)樹突細胞擴增提取RGS1基因片段并克隆到pcDNA 3.1 His/V5 Topo 載體,

13、測序確定RGS1基因正確之后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染RGS1pcDNATM3.1/V5質(zhì)粒的RAW264.7細胞在400 mg/L G418 1640培養(yǎng)基選擇下培養(yǎng)15 d后, 取4×105細胞, 用抗V5抗體染色后, 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞在紫外光下表現(xiàn)為綠色熒光, 陽性細胞比例超過80%（圖1）。圖1  RGS1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系V5抗體熒光染色（略）Fig 1  Fluorescent micrograph of RGS1 stable transfected cells with V5 antibody staining(×200)A: Morphological

14、 observation of cells;  B: Observation of transfected cells under fluorescent microscope.2.2  RGS1基因?qū)AW264.7細胞轉(zhuǎn)錄因素NFB活性的影響  用RGS1載體與NFBseap報告基因共同轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞, 24 h后取上清,利用試劑盒檢測化學(xué)發(fā)光強度（圖2）。在未加刺激條件下,控制組轉(zhuǎn)錄因素活性較低,加入1 mg/L TLR4配體LPS刺激之后,轉(zhuǎn)錄因子的活性明顯增強, 但轉(zhuǎn)染RGS1基因細胞的轉(zhuǎn)錄因子活性要顯著低于未轉(zhuǎn)染基因細胞組。經(jīng)過25 mg/L

15、 TLR3配體PolyI: C刺激之后, 轉(zhuǎn)錄因素活性明顯升高, 未轉(zhuǎn)染RGS1基因的細胞轉(zhuǎn)錄因素活性的增加更為明顯。2.3  RGS1基因?qū)AW264.7細胞表面分子表達水平的影響  轉(zhuǎn)染RGS1基因的RAW264.7細胞與對照細胞分別經(jīng)過抗體染色之后, 經(jīng)過流式細胞術(shù)分析表面分子表達水平的變化, 發(fā)現(xiàn)CD86表達明顯升高, CD80表達稍有降低, 其余沒有明顯變化（圖3）。然后利用100 nmol/ L TLR9配體BDNA, 1 mg/L TLR4配體LPS, 50 mg/L TLR2配體PGN以及25 mg/L TLR3配體Poly I: C刺激轉(zhuǎn)染RGS1基因的

16、細胞, 發(fā)現(xiàn)可以使細胞表面CD40, CD80, PD1分子表達水平與對照組相比明顯降低, 而CD86的表達水平未見明顯差異（圖4）。1         圖2  RGS1基因?qū)D(zhuǎn)錄因子NFB活性的影響（略）Fig 2  Effect of RGS1 on NFB activity with or without stimulation of LPS and Poly I:C圖3  FCM檢測RGS1基因轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞表面分子表達（略）Fig 3  FCM anal

17、ysis of expression of surface molecules by RGS1 transfected RAW264.7 cellsNote: The black, red and green lines are representing the unstained cells, RGS1 transfected cells and untransfected cells,  respectively.圖4  RGS1基因轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞經(jīng)不同Toll 樣配體刺激后細胞表面分子的表達（略）Fig 4  The expression of

18、surface molecules on the RGS1 transfected RAW264.7 cells stimulated with different Toll like receptor ligandsNote: The black, red and green lines are representing the unstained cells, RGS1 transfected cells and untransfected cells, respectively.2.4  RGS1基因?qū)AW264.7細胞因子表達水平的影響  提取轉(zhuǎn)染RGS1基因的R

19、AW264.7細胞總RNA進行基因芯片分析, 與對照細胞相比, RGS1基因使細胞因子IL6 和IL15的表達明顯升高, IL10和IL1的表達顯著降低（表1）。表1  RGS1基因轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞總RNA基因芯片分析（略）Tab  1  Global Microarray analysis of RGS1 transfected RAW264.7 cellsNote: TRAW264.7: RGS1 transfected RAW264.7 cells.3  討論    RGS蛋白控制G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 加速G亞單

20、位的GTP酶活性, 與其相關(guān)的G蛋白耦聯(lián)受體也包括部分細胞因子受體, 因此靶細胞上RGS的表達可以改變對化學(xué)因子的反應(yīng)性3。目前發(fā)現(xiàn)RGS1蛋白在淋巴細胞中可以被誘導(dǎo)表達4, 功能主要包括影響趨化因子誘導(dǎo)的B細胞的移動5和樹突細胞的移動6, 并且影響B(tài)細胞對細胞趨化因子的反應(yīng)及增強脫敏作用3。我們前期的實驗已經(jīng)證實對癌細胞引導(dǎo)的免疫耐受樹突細胞進行基因芯片分析中有多種基因表達的改變, 其中包括RGS1基因。本研究中進一步探討了轉(zhuǎn)染RGS1基因的RAW264.7細胞表面分子和細胞因子分泌的變化。    本實驗中, 我們轉(zhuǎn)染的RGS1基因細胞的轉(zhuǎn)錄因子NFB活性要顯著

21、低于未轉(zhuǎn)染基因細胞, 表明RGS1可能通過抑制NFB從而產(chǎn)生抑制腫瘤生長的作用, 已經(jīng)知道NFB可以調(diào)節(jié)刺激腫瘤細胞增殖的基因表達, 促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移7。Toll樣受體（TLR）信號可以激活NFB信號, 促進DC細胞成熟2, 8。經(jīng)過TLR配體LPS和PolyI: C刺激之后,轉(zhuǎn)染RGS1基因的細胞轉(zhuǎn)錄因子活性仍然受到抑制, 可能阻斷了TLR相關(guān)信號向下游傳導(dǎo)。經(jīng)不同Toll樣受體配體刺激后細胞表面分子的表達有不同程度的變化, 轉(zhuǎn)染RGS1基因的RAW264.7細胞CD40、CD80和PD1的表達在刺激之后受到明顯的抑制。其中, CD40是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要的共刺激分子, 其可以通過 NF

22、B上調(diào)IL6、 黏附分子(CD54)和抗凋亡蛋白表達, 促使細胞增殖。轉(zhuǎn)染RGS1基因后使CD40表達下調(diào), 可能抑制其與配體結(jié)合后促進腫瘤細胞的生長的效應(yīng), 也可能是RGS1免疫調(diào)節(jié)的機制之一。另外, 轉(zhuǎn)染RGS1基因的RAW264.7細胞協(xié)同刺激分子CD86的表達明顯升高, 而CD80的表達有所降低。有研究表明, CD80/86也是T細胞重要的協(xié)同刺激分子, RGS1蛋白對其表達調(diào)控可以影響T細胞功能, 影響其增殖和遷移9。    同樣, 在實驗中我們檢驗轉(zhuǎn)染了RGS1基因的RAW264.7細胞重要細胞因子的表達情況, 與對照細胞相比, IL15的表達明顯升高

23、, 已知它可以促進NK細胞增殖及細胞毒活性。表達同樣增加的IL6為重要的炎性因子, 可增加T、 B細胞的增殖, 分化, 并腫瘤的黏附, 刺激腫瘤特異性抗原的表達10。腫瘤耐受樹突細胞RGS1基因表達的上調(diào)并由此IL6的水平增高,反映了RGS1基因可能的對免疫功能的調(diào)節(jié)作用, 具體機制還需要進一步的研究。    RGS1基因在免疫調(diào)節(jié)過程中的具體的分子機制尚不十分清楚。在本實驗當(dāng)中, 我們所用TLR配體刺激的劑量也可能對結(jié)果產(chǎn)生影響, 具體還需要深入研究。我們推測, RGS1基因有可能作用于Toll樣受體信號通路的下游分子發(fā)揮阻斷作用, 同時其對未活化細胞表面分子表

24、達改變的機制仍不十分明了, 均有待深入研究?！尽?#160; 1 Beriou G, Peche H, Guilonneau C, et al. Donorspecific allograft tolerance by administration of recipientderived immature dendritic cells and suboptimal immunosuppressionJ. Transplantation, 2005, 79(8): 969-972.2 Shi GX, Harrison K, Han SB, et al. Tolllike receptor signaling alters the expression of regulator of G