HA-1樹突狀細胞核酸疫苗的構建及其特異性CTL的誘導

1、HA-1樹突狀細胞核酸疫苗的構建及其特異性CTL的誘導         08-03-07 11:49:00     編輯：studa20         作者：汪涯雅，張東華，劉文勵，周紅升，張路，戴敏，黃振倩， 譚獲熊平 【摘要】  本研究以次要組織相容性抗原HA-1為靶點，構建HA-1樹突狀細胞核酸疫苗用于造血干細胞移植后抗白血病治療。體外培養(yǎng)移植供者樹突狀細胞，用流式細胞術、混合淋

2、巴細胞反應檢測其免疫活性，通過電轉法將HA-1基因轉染樹突狀細胞，構建樹突狀細胞核酸疫苗。48小時后檢測HA-1蛋白表達情況。將轉染后的樹突狀細胞與同基因淋巴細胞共孵育誘導特異性CTL，應用LDH釋放實驗檢測其體外殺傷活性。結果表明：經外周血單核細胞誘導的樹突狀細胞表達樹突狀細胞表型，能刺激同種淋巴細胞增殖。電轉48小時后，Western blot可檢測到HA-1蛋白表達。誘導的CTL體外殺傷活性高于對照組。結論：次要組織相容性抗原HA-1可作為造血干細胞移植后抗白血病治療的靶點。 【關鍵詞】  樹突狀細胞； HA-1基因; 樹突狀細胞核酸疫苗; 造血干細胞移植; 細胞毒性T淋巴細胞

3、Construction of HA-1-DC Nucleic-acid Vaccine and Induction of Specific Cytotoxic T LymphocytesAbstractThe purpose of this study was to construct a HA-1-DC nucleic acid vaccine and to induce anti-leukemia effect after hematopoietic stem cell transplantation(HSCT). The dendritic cells (DCs) were gener

4、ated from HSCT donors in vitro, and its immunologic activity was studied by using flow cytometry and mix lymphocyte reaction. HA-1 gene was electroporated into the cultured DCs to construct a DC nucleic acid vaccine. After transfecting for 48 hours, the expression of HA-1 protein was detected by Wes

5、tern blot. The DCs were cultured with isogenic lymphocytes to induce specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). The cytotoxicity of the CTLs was detected by LDH assay. The results showed that the DCs derived from peripheral blood monocytes (PBMCs)  expressed the DC phenotype, and were effective i

6、n stimulating proliferation of the allogenic lymphocytes. After electroporating for 48 hours, HA-1 protein was detected by Western blot. The cytotoxity of inducing CTLs was higher than that in the control group. It is concluded that the minor histocompatibility antigen HA-1 can be considered as a ta

7、rget of immunotherapy against leukemia after HSCT.Key wordsdendritic cell； HA-1 gene； DC nucleic acid vaccine； hematopoietic stem cell transplantation； cytotoxic T lymphocyte樹突狀細胞（dendritic cell, DC）是目前體內功能最強的專職抗原呈遞細胞（antigen presenting cell, APC），它們能高效攝取、處理抗原，并將多肽呈遞給靜息型T細胞，誘導特異性免疫應答，因而成為腫瘤免疫治療中重要的運

8、載工具。通過轉基因技術，將編碼腫瘤表面的抗原基因導入DC構建相應的核酸疫苗，是近來腫瘤免疫治療的熱點1，2。異基因造血干細胞移植（allogeneic hemato- poietic stem cell transplantation, allo-HSCT） 是治療白血病最有效的方法， 但移植后移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)和復發(fā)嚴重影響了病人的存活率。如何增強移植物抗白血病（graft versus leukemia, GVL）效應，減少復發(fā)同時又不誘發(fā)GVHD，是移植成功的關鍵。限制性表達于造血干細胞和白血病細胞表面的次要組織相容性抗原（m

9、inor histocompatibility antigens, mHags）在分離GVL和GVHD中起重要的作用3。 因此， 本實驗應用HA-1基因構建真核表達載體，轉染DC，誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs），發(fā)揮抗白血病效應。材料和方法材料人重組IL-4和GM-CSF均購自Peprotech公司，淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠，RPMI 1640、絲裂霉素C、MTT均為Sigma公司產品，胎牛血清（FCS）購自杭州四季清公司。PE標記的鼠抗人單克隆抗體CD80和CD14、FITC標記的鼠抗人單克隆抗體CD83和CD86及同型對照均

10、購自eBioscience公司。Xba和BamH限制性內切酶、1 kb DNA Marker購自MBI公司。膠回收、質粒小提、大提試劑盒均購自上海華舜公司。T4DNA連接酶為Promega公司產品?？筯is單克隆抗體購自Novagen公司。人IL-2購自北京四環(huán)生物制品廠。pcDNA3.1/hisA和pEGFP-C1 由我院婦科腫瘤中心陳剛博士惠贈，pcDNA3.1-HA-1由荷蘭勒登(Leiden)大學醫(yī)學中心Dr.Prof.E.A.J.M.Goulmy惠贈。流式細胞儀（Becton Dickinson公司產品），電轉儀（ECM2001 BTX公司產品），電轉杯（8mmgap,GTS公司產品

11、），酶標儀（Biotech公司產品）。方法DC體外培養(yǎng)取HA-1陰性表達的移植供者外周血，用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，PBS液洗滌3次，用RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞，按5×106/ml接種于6孔板中，每孔2 ml，置37、5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，輕輕吹打去除懸浮細胞，即獲得貼壁的外周血單核細胞（PBMC），每孔加入2 ml含10FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液，加入細胞因子rhGM-CSF 100 ng/ml及rhIL-4  40 ng/ml。隔天半量換液，補充細胞因子。于培養(yǎng)第7天收集懸浮細胞。流式細胞術分析表型DC懸液用PBS液洗滌2次，調整細胞濃度為

12、1×106/ml，加入Eppendorf管，每管100 l，再分別加入PE標記的CD80、CD14及FITC標記的CD83、CD86，4避光孵育30分鐘，PBS液洗滌，1多聚甲醛固定后上流式細胞儀檢測。同種混合淋巴細胞反應分離健康人外周血獲得單個核細胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，收集懸浮細胞即同種異體淋巴細胞作為反應細胞，刺激細胞（DC及同基因的PBMC）用完全培養(yǎng)液調整濃度為1×106/ml，加入終濃度25 g/ml的絲裂霉素C，37孵育30分鐘，PBS液洗滌3次，用含8FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮調整濃度，分別以1×103/孔、5×103/孔和1

13、×104/孔加入96孔板中，每組設3個復孔，每孔再加入1×105反應細胞，終體積為200 l，以未加刺激細胞的淋巴細胞為陰性對照。37、5 CO2 培養(yǎng)72小時，每孔加入20 l   MTT(5    mg/ml)，避光37溫箱中孵育4小時，離心去上清，每孔加入200 l  DMSO,取波長570 nm檢測A570值。結果用3孔均值表示。刺激指數(shù)（SI）=加刺激細胞孔的A570值/陰性對照孔的A570值。重組人HA-1質粒的構建用XbaI和BamHI限制性內切酶從pcDNA3.1-HA-1中切下358 bp HA-1的cDNA，其中包括T細胞決定簇VLHDDLLEA，經T4DNA連接酶插入pcDNA3.1/hisA的多克隆位點中，經過酶切和測序確定重組是否準確，命名為pcDNA3.1/hisA-HA-1。轉染DC收集培養(yǎng)7天的DC，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌，電轉緩沖液（按Eppendorf公司提供的緩沖液配方配置，保證細胞在其中孵育30分鐘，存活率在90以上）重懸細胞，調整濃度為1×106/ml，加入重組質粒，終濃度為20 g/ml。電轉條件為：常溫，電壓450 V，80微秒，脈沖1次。在30分鐘內完成，加入完全培養(yǎng)