第二代高通量測(cè)序地三大巨頭比拼

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案第二代高通量測(cè)序的三大巨頭比拼（之一）第二代高通量測(cè)序準(zhǔn)確率，延長(zhǎng)度都明顯優(yōu)于第一代高通量測(cè)序，更重要的是， 價(jià)格比第一代大幅度降低，使得高通量測(cè)序的產(chǎn)業(yè)化成為現(xiàn)實(shí)。第二代高通量測(cè)序儀的三大代表是Illumina公司的 Solexa 基因組分析儀 (Illumina Genome Analyzer)，羅氏公司 (Roche) 的454 測(cè)序儀 (Roch GS FLX sequencer)和 ABI 的 SOLiD 測(cè)序儀 (ABI SOLiD se-quencer)。摘要： 第二代高通量測(cè)序準(zhǔn)確率，延長(zhǎng)度都明顯優(yōu)于第一代高通量測(cè)序，更重要的是，價(jià)格比第一代大幅度降低，使得高通量測(cè)

2、序的產(chǎn)業(yè)化成為現(xiàn)實(shí)。一、 Illumina公司的 Solexa基因組分析儀Illumina公司的新一代測(cè)序儀GenomeAnalyzer最早由 Solexa公司研發(fā)，利用其專利核心技術(shù)“ DNA 簇”和“可逆性末端終結(jié)（reversible terminator）”，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及基因組數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基大規(guī)模平行測(cè)序。Genome Analyzer作為新一代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，具有高準(zhǔn)確性， 高通量， 高靈敏度， 和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋） 以及功能基因組學(xué)（基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能， 蛋白 / 核酸相互作用）研究。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案1 、 Genome

3、Analyzer技術(shù)的基本原理：Solexa 方法是利用單分子陣列測(cè)試genotyping，此種測(cè)序法首先將DNA從細(xì)胞中提取，然后將其打斷到約100 200bp 大小，再將接頭連接到片段上，經(jīng)PCR擴(kuò)增后制成 Library 。隨后在含有接頭的芯片 （flow cell ）上將已加入接頭的 DNA片段綁定在 flowcell 上，經(jīng)反應(yīng)，將不同片段擴(kuò)增。在下一步反應(yīng)中，四種熒光標(biāo)記的染料應(yīng)用邊合成邊測(cè)序的原理， 在每個(gè)循環(huán)過(guò)程里，熒光標(biāo)記的核苷和聚合酶被加入到單分子陣列中?；パa(bǔ)的核苷和核苷酸片斷的第一個(gè)堿基配對(duì)，通過(guò)酶加入到引物上。多余的核苷被移走。 這樣每個(gè)單鏈 DNA 分子通過(guò)互補(bǔ)堿基的

4、配對(duì)被延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光素酶，可通過(guò)堿基加到引物后端時(shí)所釋放出的焦磷酸鹽來(lái)提供檢測(cè)信號(hào)。針對(duì)每種堿基的特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)結(jié)合上的核苷的標(biāo)記，這個(gè)標(biāo)記會(huì)釋放出熒光。 熒光信號(hào)被 CCD 采集， CCD 快速掃描整個(gè)陣列檢測(cè)特定的結(jié)合到每個(gè)片斷上的堿基。通過(guò)上述的結(jié)合， 檢測(cè)可以重復(fù)幾十個(gè)循環(huán)，這樣就有可能決定核苷酸片斷中的幾十個(gè)堿基。Solexa 的這種方法， 可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)加入4 種核苷的標(biāo)簽， 采用邊合成邊測(cè)序 （ SBS sequencing by synthesis ），可減少因二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡(jiǎn)單易操作的

5、自動(dòng)化平臺(tái)和功能強(qiáng)大等特點(diǎn)，此反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)上億個(gè)核苷酸片斷, 因此在同一個(gè)芯片或幾個(gè)芯片上花費(fèi)很少（只需常規(guī)方法的1）的成本就可測(cè)試全基因組。2、 Solexa 高通量測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)：1）可擴(kuò)展的超高通量 ：Genome Analyzer 系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20GB 的高品質(zhì)過(guò)濾數(shù)據(jù)。 這個(gè)技術(shù)的可擴(kuò)展性保證了更高的數(shù)據(jù)密度和輸出，能用更少的經(jīng)費(fèi)完成更復(fù)雜的項(xiàng)目。到今年底，通量還有望上升到95 GB ，相當(dāng)于人類基因組的 30倍覆蓋度。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案2 ）需要樣品量少 ： Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng ，能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀

6、、顯微切割等）中。這也是很多研究人員所考慮的因素。3 ）簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化： Genome Analyzer系統(tǒng)提供了最簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)潔的工作流程。即使是最小的實(shí)驗(yàn)室也能像大型基因組中心一樣進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。制備樣品文庫(kù)可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，一個(gè)星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。Cluster Station可以說(shuō)是GenomeAnalyzer 的核心。由獨(dú)立軟件控制的自動(dòng)生成DNA 簇的過(guò)程可以在5 小時(shí)之內(nèi)（ 30 分鐘手工操作）完成。這個(gè)自動(dòng)化的流程不需要進(jìn)行Emulsion PCR，減少了手工操作誤差和污染可能性， 也不需要機(jī)器人操作或潔凈室?？焖俚膶?shí)驗(yàn)流程使Genome Analyzer的能力增

7、至最大，而自動(dòng)化步移降低了項(xiàng)目的時(shí)間和費(fèi)用。4) 新穎的測(cè)序化學(xué)技術(shù) ：Genome Analyzer通過(guò)合成測(cè)序來(lái)支持大規(guī)模并行測(cè)序。利用新穎的可逆熒光標(biāo)記終止子，可以在DNA 鏈延伸的過(guò)程中檢測(cè)單個(gè)堿基摻入。由于四個(gè)可逆終止子 dNTP 在每個(gè)測(cè)序循環(huán)都存在，自然的競(jìng)爭(zhēng)減少了摻入的誤差。5) 單個(gè)或配對(duì)末端支持 ：Genome Analyzer系統(tǒng)支持單個(gè)片段或配對(duì)末端文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單， 減少了樣品分離和制備的時(shí)間。制備基因組DNA 的單個(gè)片段或配對(duì)末端文庫(kù)需要 6 個(gè)小時(shí)， 只有 3 個(gè)小時(shí)需要手工操作。 2 ×50 個(gè)堿基或更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)增加了比對(duì)基因組的能力，并拓展了在其

8、他方面的應(yīng)用。3 、實(shí)驗(yàn)流程1 ） 文庫(kù)制備將基因組DNA打成幾百個(gè)堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭(adapter)。2） 產(chǎn)生 DNA 簇精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA 片段變成單鏈后通過(guò)與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端“固定”在芯片上。另外一端（5或 3）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)， 也被“固定” 住，形成“橋(bridge)“。反復(fù) 30 輪擴(kuò)增， 每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。 DNA簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測(cè)序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。3 ）測(cè)序Genome Analyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合

9、成邊測(cè)序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造過(guò)的DNA 聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP 。 這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?3 羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。目前的配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到2 ×50bp ，更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長(zhǎng)會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰

10、減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。4 ）數(shù)據(jù)分析自動(dòng)讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析4 、 Genome Analyzer系統(tǒng)得到國(guó)內(nèi)外大型研究機(jī)構(gòu)的認(rèn)可Genome Analyzer系統(tǒng)之所以如此暢銷，關(guān)鍵在于其技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)去年底的數(shù)據(jù)， Genome Analyzer已售出約200 臺(tái)，估計(jì)是市場(chǎng)占有率最廣的。前不久，華大基因再添置了12臺(tái)，準(zhǔn)備放在香港和深圳的實(shí)驗(yàn)室，至此華大基因已經(jīng)有29臺(tái)GenomeAnalyzer 。而著名的麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad 研究院擁有47 臺(tái) Illumina測(cè)序儀。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案眾多實(shí)驗(yàn)室之所以選擇Illumina

11、，看中的無(wú)疑是Genome Analyzer的高性價(jià)比。上個(gè)月， Illumina將 Genome Analyzer II升級(jí)到 Genome Analyzer IIx，距年底實(shí)現(xiàn)單次運(yùn)行獲得95 GB 數(shù)據(jù)的宏偉目標(biāo)又近了一步。Genome Analyzer IIx有兩個(gè)核心特征：其一是更大的試劑冷卻器，支持超過(guò)100個(gè)測(cè)序循環(huán)，進(jìn)一步提升了系統(tǒng)的易用性和自動(dòng)化；其二是全新的流動(dòng)池支架，讓每輪運(yùn)行所得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)增加20% 。依靠系統(tǒng)軟件和試劑的改進(jìn)， Genome Analyzer IIx現(xiàn)在能夠支持100 bp以上的配對(duì)末端讀長(zhǎng)，并在每次運(yùn)行中產(chǎn)生超過(guò)20 GB 的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。第二代高通

12、量測(cè)序的三大巨頭比拼（之二）摘要：羅氏公司(Roche)的 454測(cè)序儀結(jié)合了DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)(emulsion system)和皮升級(jí)焦磷酸(pyrophosphate)為基礎(chǔ)的測(cè)序方法焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)方法。二、羅氏公司(Roche)的 454測(cè)序儀(Roch GS FLX sequencer)羅氏2005年，在國(guó)際頂級(jí)的學(xué)術(shù)期刊Nature上，來(lái)自454生命科學(xué)公司的Margulies等人發(fā)表文章介紹了一種快速簡(jiǎn)單的測(cè)序方法：結(jié)合了DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)(emulsionsystem)和皮升級(jí)焦磷酸(pyrophosphate)為基礎(chǔ)的測(cè)序方法焦磷酸測(cè)序(pyr

13、osequencing)方法。這是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)；在DNA聚合酶，ATP 硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無(wú)和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化的特點(diǎn)。1 、 GS FLX 系統(tǒng)的工作流程GS FLX 系統(tǒng)的流程概括起來(lái)，就是“ 一個(gè)片段=一個(gè)磁珠= 一條讀長(zhǎng)（Onefragment = One bead = One read） ” 。1 ） 樣品輸入并片

14、段化： GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來(lái)源的樣品，包括基因組DNA 、PCR 產(chǎn)物、 BAC 、 cDNA、小分子RNA 等等。大的樣品例如基因組DNA或者 BAC等被打斷成 300 800bp的片段；對(duì)于小分子的非編碼RNA或者 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR 產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3)。2 ） 文庫(kù)制備 ：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3 和5 端具有特異性） 連接到DNA 片段上。 接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測(cè)序步驟。 具有 A 、B 接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫(kù)。3 ） 一個(gè)DNA片段一個(gè)磁珠：?jiǎn)捂淒NA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)

15、磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。4 ） 乳液PCR 擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。5 ） 一個(gè)磁珠一條讀長(zhǎng)：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP 板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。PTP 孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)磁珠（20um）。然后將PTP 板放置在GS FLX中，測(cè)序開(kāi)始。放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四

16、種堿基，依照T、A、C、G的順序精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案依次循環(huán)進(jìn)入PTP 板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP 硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過(guò)一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對(duì)應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測(cè)序。6 ） 數(shù)據(jù)分析： GS FLX 系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò) 4-6 億個(gè)堿基信息。 GS FLX 系統(tǒng)

17、提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400 MB 的從頭拼接和任何大小基因組的重測(cè)序。GS FLX 系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上。其主要限制來(lái)自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如 AAA或 GGG 。由于沒(méi)有終止元件來(lái)阻止單個(gè)循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長(zhǎng)度就需要從信號(hào)強(qiáng)度中推斷出來(lái)。這個(gè)過(guò)程就可能產(chǎn)生誤差。因此，454測(cè)序平臺(tái)的主要錯(cuò)誤類型是插入- 缺失，而不是替換。2 、 454 GS測(cè)序系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)數(shù)據(jù)高效獲取10 小時(shí)內(nèi)可得到超過(guò)1000000條的序列，平均讀長(zhǎng)高達(dá)450bp!極大的拓展研究思路， 大量的高讀長(zhǎng)的序列，為研究者提供更廣闊的思路！獲取等量數(shù)據(jù)，比傳

18、統(tǒng)方法的花費(fèi)大大降低， 454 Titanium系統(tǒng)，可以幫助您：1 ）獲取各個(gè)物種的基因組序列草圖2 ）大規(guī)模 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序3 ）尋找基因組中， Sanger 測(cè)序法不能發(fā)現(xiàn)的稀有突變4 ）開(kāi)放閱讀框 (ORF) 的鑒定，不同生物間的同源性分析，基因組結(jié)構(gòu)概況分析5 ）鑒定不同菌株的保守區(qū)域，突變熱點(diǎn)和基因插入或者缺失，了解藥物抗性的遺傳基礎(chǔ)精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案6) 識(shí)別微生物產(chǎn)生的藥物前體有關(guān)的基因或者途徑，比較致病性和非致病性微生物的區(qū)別作為發(fā)展抗微生物藥物的遺傳學(xué)基礎(chǔ)7) 進(jìn)行病毒基因組、microRNA、 SAGE 文庫(kù)、cDNA文庫(kù)和BAC文庫(kù)的測(cè)序第二代高通量測(cè)序的三大巨

19、頭比拼（之三）摘要： 第二代高通量測(cè)序的三大巨頭比拼（之三）ABI 的 SOLiD 測(cè)序儀三、 ABI 的 SOLiD測(cè)序儀(ABI SOLiD se-quencer)SOLiD全稱為supported oligo ligation detetion， SOLiD系統(tǒng)是一個(gè)端到端的新一代基因組研究方案，包含測(cè)序組件、化學(xué)組件、計(jì)算集群和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)組件。這個(gè)平臺(tái)基于通過(guò)寡核苷酸連接和檢測(cè)進(jìn)行測(cè)序。它的獨(dú)特之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測(cè)序。與聚合酶測(cè)序方法不同的是，SOLiD系統(tǒng)利用專利的逐步連接（ s

20、tepwise ligation）技術(shù)來(lái)產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，可應(yīng)用于全基因組測(cè)序、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、微生物測(cè)序、數(shù)字核型分析、 臨床測(cè)序、 基因型分析、 基因表達(dá)分析和小分子RNA的發(fā)現(xiàn)等等。就通量而言，SOLiD 3系統(tǒng)是革命性的， 目前SOLiD 3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)， 相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。而其無(wú)以倫比的準(zhǔn)確性、系統(tǒng)可靠性和可擴(kuò)展性更讓它從其他新一代測(cè)序平臺(tái)中脫穎而出。為什么SOLiD能輕松實(shí)現(xiàn)貌似不可能的任務(wù)？讓生物通帶你從測(cè)序原理入手，一探究竟。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案1 、 SOLiD工作流程1 ）文庫(kù)制備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板：片段文庫(kù)(fr

21、agment library)或配對(duì)末端文庫(kù)(mate-pairedlibrary)。使用哪一種文庫(kù)取決于你的應(yīng)用及需要的信息。片段文庫(kù)就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫(kù)。如果你想要做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、miRNA探索、重測(cè)序、3 , 5-RACE、甲基化分析、ChIP測(cè)序等，就可以用它。如果你的應(yīng)用是全基因組測(cè)序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)，則需要用配對(duì)末端文庫(kù)。配對(duì)末端文庫(kù)是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接， 再環(huán)化，然后用EcoP15酶切，使中間接頭兩端各有27bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫(kù)。2 ）乳液 PCR/ 微珠富集在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR 反

22、應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR（ Emulsion PCR ）。 PCR 完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過(guò)3 修飾，可以與玻片共價(jià)結(jié)合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識(shí)的感覺(jué)呢？那就對(duì)了，此步驟與454的 GS FLX 基本相同。 不過(guò)SOLiD系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1 um。乳液PCR 最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“ 注水到油” ，基本過(guò)程是在PCR 反應(yīng)前，將包含PCR 所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無(wú)數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR 反應(yīng)空間

23、。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)P1 磁珠，由于水相中的P2 引物和磁珠表面的P1 引物所介導(dǎo)的PCR 反應(yīng)，這個(gè) DNA 模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加， PCR 反應(yīng)結(jié)束后， P1 磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來(lái)源 DNA 模板擴(kuò)增產(chǎn)物。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案3 ）微珠沉積3 修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過(guò)程中，沉積小室將每張玻片分成1 個(gè)、 4 個(gè)或8 個(gè)測(cè)序區(qū)域。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。4 ）連接測(cè)序這一步可就是SOLiD的獨(dú)門秘笈了。它的獨(dú)特之處在于沒(méi)有采用慣常的聚合酶，而用了連接酶。SOLi

24、D連接反應(yīng)的底物是8 堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5 末端分別標(biāo)記了CY5 、Texas Red 、 CY3、 6-FAM這 4種顏色的熒光染料。探針3端15 位為隨機(jī)堿基，可以是 ATCG 四種堿基中的任何一種堿基，其中第1 、2 位構(gòu)成的堿基對(duì)是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對(duì)和4種探針顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系，而3 5 位的 “ n ” 表示隨機(jī)堿基，6 8位的 “ z” 指的是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基。單向 SOLiD 測(cè)序包括五輪測(cè)序反應(yīng)， 每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)。第一輪測(cè)序的第一次

25、連接反應(yīng)由連接引物“ n ” 介導(dǎo)，由于每個(gè)磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針， SOLiD 測(cè)序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息， 隨后的化學(xué)處理斷裂探針3端第 5、 6位堿基間的化學(xué)鍵， 并除去 68位堿基及 5 末端熒光基團(tuán)， 暴露探針第 5 位堿基5 磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因?yàn)榈谝淮芜B接反應(yīng)使合成鏈多了5個(gè)堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6 、 7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11 、12位堿基序列的顏色信息幾個(gè)循環(huán)之后，引物重置，開(kāi)始第二輪的測(cè)序。由于第二輪連接引物n-1比第一精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案輪錯(cuò)開(kāi)一位，所以第二

26、輪得到以0 ， 1 位起始的若干堿基對(duì)的顏色信息。五輪測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0 、 1 位，第1 、 2 位 .的順序把對(duì)應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來(lái)，就得到由“0 ， 1 ， 2 ， 3 ” 組成的SOLiD原始顏色序列。5 ）數(shù)據(jù)分析SOLiD測(cè)序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來(lái)說(shuō)，按照“ 雙堿基編碼矩陣” ，只要知道所測(cè)DNA序列中任何一個(gè)位置的堿基類型，就可以將 SOLiD 原始顏色序列“ 解碼” 成堿基序列。 但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡(jiǎn)并特性（一種顏色對(duì)應(yīng)4 種堿基對(duì)），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼， 所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起“ 連鎖解碼錯(cuò)誤” ，改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測(cè)序儀一樣， 測(cè)序錯(cuò)誤在所難免， 關(guān)鍵是對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤的評(píng)價(jià)和后續(xù)處理。由于 SOLiD 系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)， 在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤， 提供內(nèi)在的校對(duì)功能。 這樣， 雙保險(xiǎn)確保了SOLiD系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于 99.94%，而在 15X 覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999% ，是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。為避免 “ 連鎖解碼錯(cuò)誤 ” 的發(fā)生， SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD 原始顏色序列解碼成堿基