人補(bǔ)體C5b～9復(fù)合物對大鼠腎系膜細(xì)胞一氧化氮生成的影響

1、    人補(bǔ)體C5b9復(fù)合物對大鼠腎系膜細(xì)胞一氧化氮生成的影響        摘要目的：探討人補(bǔ)體 C5b9復(fù)合物對大鼠腎小球系膜細(xì)胞(MC)合成一氧化氮(NO)的影響。方法：首先提取人補(bǔ)體C5b9復(fù)合物，同時培養(yǎng)出大鼠腎小球MC。然后用C5b9復(fù)合物刺激MC，觀察刺激后6 h、24 h、和48 h培養(yǎng)上清液中NO代謝產(chǎn)物-硝酸根(NO-3)和亞硝酸根(NO?2)量的變化，并測定刺激后24 h、48 h時MC內(nèi)環(huán)鳥苷酸(cGMP)的水平。結(jié)果：用人C5b9復(fù)合物刺激大鼠MC后

2、可致培養(yǎng)上清中NO?3/NO?2含量增加，細(xì)胞內(nèi)cGMP水平上升。NO合成增多能夠被NO合酶(NOS)抑制劑-NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)所抑制。結(jié)論：人C5b9復(fù)合物能夠增加大鼠腎MC 的NO合成。主題詞補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物；腎小球膜； 細(xì)胞；一氧化氮；大鼠中分類號 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1000-4718(2000)03-0262-04 The effect of human complement C5b9 complex on nitric oxide synthesis in glomerular mesangial cells of ratsWANG Ying-wei,

3、 HE Qiu-zao, QIN Hui-lian, TANG Ren-xian, GAO Feng-guang, ZHANG Guang-yi(Dept of Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China)AbstractAIM：To study the effect of human complement C5b9 complex on nitric oxide(NO) synthesis of glomerular mesangial cells (MC). METHODS: First, the human compl

4、ement C5b9 complexes were isolated and glomerular MC of rats were cultured. Second, the MC were stimulated with C5b9 complex and changes of metabolism products of NO（NO?3 and NO?2） in MC culture supernatant at 6,24 and 48 hours after C5b9 stimulating were detected. Moreover, cGMP levels in cultured

5、MC were also measured. RESULTS： NO?3NO?2 contents from culture supernatant and cGMP levels in MC were increased parallelly after C5b9 complex stimulation. Further, NO synthesis was inhibited by L-NG-nitro-arginine-methylester(L-NAME). CONCLUSION： NO synthesis of rat glomerular MC was incerased by hu

6、man complement C5b9 stimulation. MeSHComplement membrane attack complex; Glomerular mesangium; Cells; Nitric oxide; Rats近年來對一氧化氮(nitric oxide， NO)參與機(jī)體組織功能的變化日益為人們所關(guān)注1。腎小球炎癥時，NO合成的增加不僅可以改變腎小球的濾過率，而且還可引發(fā)腎細(xì)胞的病理損傷。已有資料表明，腎炎時腎內(nèi)NO合成的增多與某些刺激因子如細(xì)菌脂多糖，腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor ，TNF）等作用密切相關(guān)2。另有實驗證實，補(bǔ)體C5b9

7、復(fù)合物可作為腎細(xì)胞有效的刺激劑。亞溶量的C5b9復(fù)合物能夠插入細(xì)胞膜磷脂雙層，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)并激活細(xì)胞多種代謝途徑，致使炎性介質(zhì)釋放，蛋白酶活化及代謝產(chǎn)物的堆積等3，4。本文利用提取的人補(bǔ)體C5b9復(fù)合物作為刺激因子，觀察它對體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC)合成NO的影響。材料和方法一、主要材料健康人血清由徐州市中心血站健康B型獻(xiàn)血員提供。小牛血清購自南京衛(wèi)崗血清廠。型膠原酶、牛胰島素、L-精氨酸、L-NAME及3-異丁甲基黃嘌呤(3-isobuthyl-1-methylxanthine，IBMX)均屬Sigma公司產(chǎn)品。RPMI 1640干粉購自GIBCO

8、公司。單克隆抗結(jié)蛋白、肌動蛋白、細(xì)胞角蛋白及第因子抗體為DAKO公司產(chǎn)品。多克隆抗人C3、C5和C9抗體及ABC法染色試劑購自上海生物制品研究所，多克隆抗人C5b9復(fù)合物及C5b9標(biāo)準(zhǔn)抗原由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所生化室提供。NO-3/NO-2測定試劑盒由南京建成生物工程研究所供應(yīng)。35b9復(fù)合物的提取取新鮮正常人血清300mL加入等體積10的兔紅細(xì)胞懸液，37水浴至兔紅細(xì)胞全部溶血，離心洗滌沉淀的兔紅細(xì)胞膜，再用10%脫氧膽酸鈉溶解。樣品經(jīng)不同梯度蔗糖超速離心180?000×g 3h后分段分管收集。各管液體先行電鏡負(fù)染法檢查提取物，再分別用抗人C3、C5、C9及抗人C5b9復(fù)合物抗體進(jìn)

9、行斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA）法鑒定。鑒定后的人補(bǔ)體C5b9復(fù)合物經(jīng)透析和超濾濃縮后按Lowry法測定蛋白量，-20保存。具體步驟參見文獻(xiàn)5，6。2.大鼠腎MC的培養(yǎng)與鑒定取SD大鼠5只，雌性，體重150200 g，乙醚麻醉后經(jīng)胸主動脈插管用冷Hanks液灌洗雙腎，剪取的腎皮質(zhì)經(jīng)50目、100目及200目不銹鋼篩網(wǎng)分離收獲腎小球，然后加入型膠原酶消化20 min。消化后的腎小球置于完全營養(yǎng)液（RPMI 164020小牛血清0.66 UmL胰島素)37 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)各期的MC用倒置顯微鏡、光鏡、電鏡作常規(guī)檢查。原代培養(yǎng)2周及傳代培養(yǎng)1周的MC以單克隆抗結(jié)蛋白、肌動蛋白、角

10、蛋白及第VIII因子抗體為一抗，行常規(guī)ABC法染色鑒定。3. C5b9復(fù)合物刺激劑量的確定及MC的分組處理原代培養(yǎng)3周的MC配成1×10mL懸液后轉(zhuǎn)種24孔培養(yǎng)板。傳代第3 d將培養(yǎng)液換成不含酚紅液的RPMI 1640營養(yǎng)液(添加10小牛血清及1 mmolL精氨酸)培養(yǎng)24 h。然后取1塊24孔培養(yǎng)板按不同濃度加入C5b9復(fù)合物(1g、10g、20g、40g及80gmL)靜置培養(yǎng)24 h，分別收集各孔的培養(yǎng)上清液用NO測定試劑盒測定NO?3/NO?2含量，根據(jù)NO?3NO?量確定C5b9復(fù)合物刺激的最佳劑量(注：此次以40gmL C5b9復(fù)合物刺激效果最好)。其余培養(yǎng)板中的MC分別作

11、如下處理：(1)C5b9組：每孔加含C5b9復(fù)合物40g/mL的營養(yǎng)液1mL。(2)L-NAME組：每孔加入含2mmolL的 L-NAME營養(yǎng)液1 mL。(3)C5b9L-NAME組：每孔中加入含C5b9復(fù)合物40gmL及含2 mmolL的L-NAME營養(yǎng)液1 mL。(4)對照組：每孔僅加營養(yǎng)液1 mL。各組均設(shè)6個復(fù)孔。4. 檢測指標(biāo)（1）NO?3NO?2含量：上述分組處理的各孔培養(yǎng)的MC繼續(xù)培養(yǎng)6h、24h、48h后分別收集其培養(yǎng)上清液用硝酸還原酶法測定上清液中NO?3NO?2的濃度。結(jié)果以mol/L表示。（2）cGMP水平分組處理同前所述，但各組所用的試劑中再加入終濃度為0.5 mmol

12、L IBMX，培養(yǎng)24 h和48 h后棄去營養(yǎng)液，細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次。留于孔內(nèi)的細(xì)胞再用5冷三氯醋酸處理1h。樣品吸出后三氯醋酸經(jīng)水飽和乙醚抽提4次除去。各組樣品用3H-cGMP放免分析試劑盒測定其cGMP含量?？變?nèi)的MC蛋白經(jīng)1SDS溶解過夜，Lowry法定蛋白含量。最后以所測各孔cGMP值除以各孔MC蛋白量進(jìn)行計算，結(jié)果以pmol/mg蛋白表示。三、統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)用±s表示，均數(shù)差異顯著性用計算機(jī)PEMS軟件檢驗判斷。結(jié)果一、人C5b9復(fù)合物的鑒定抽提的人C5b9復(fù)合物樣品經(jīng)不同梯度蔗糖超速離心后可見離心管中上部有一乳白色的致密環(huán)，電鏡負(fù)染顯示該致密物中主要是一些呈空心環(huán)狀

13、、形或樣的結(jié)構(gòu)，這與國外文獻(xiàn)報道的結(jié)果基本一致。另用Dot-ELISA法檢測表明，提取的人C5b9復(fù)合物經(jīng)抗人C5、C9和C5b9抗體染色均呈陽性，而用抗人C染色呈陰性反應(yīng)。二、腎小球MC的培養(yǎng)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)三道篩網(wǎng)分離的腎小球純度達(dá)90%以上。原代培養(yǎng)46天腎小球多已貼壁。最初從腎小球中長出的細(xì)胞含有圓形或卵圓形的上皮細(xì)胞，2周后上皮細(xì)胞漸漸死亡，殘留的MC多呈星形，梭形或不規(guī)則狀。HE染色鏡檢MC形態(tài)有不規(guī)則突起。培養(yǎng)的MC電鏡下可見富含微絲結(jié)構(gòu)。原代培養(yǎng)2周后或傳代培養(yǎng)的MC經(jīng)免疫組化染色顯示胞漿內(nèi)結(jié)蛋白，肌動蛋白呈陽性，而細(xì)胞角蛋白(上皮細(xì)胞含有)，第因子(內(nèi)皮細(xì)胞含有)呈陰性

14、。由此排除了上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞混雜生長的可能性。三、C5b9復(fù)合物對MC產(chǎn)生NO-3/NO-的影響培養(yǎng)的MC用不同劑量人C5b9復(fù)合物刺激24h時取各孔培養(yǎng)上清液測定NO-3/NO-2含量，與不加任何刺激物的對照組相比，差異以40gmL、80gmL C5b9用量效果最為顯著（P0.01），見表1。故在以后的實驗中以40gmL C5b9復(fù)合物作為刺激劑量，按方法3分組檢測傳代培養(yǎng)的MC經(jīng)6 h、24 h和48 h培養(yǎng)后其上清液中的NO-3/NO-2含量變化，結(jié)果見表2。四、C5b9復(fù)合物刺激對MC細(xì)胞內(nèi)cGMP的影響以劑量為40gmL的C5b9復(fù)合物刺激，傳代培養(yǎng)的MC按表3分組處理后經(jīng)24 h

15、、48 h時分別取樣測定MC胞內(nèi)cGMP含量，結(jié)果列于表3。表1不同濃度的C5b9復(fù)合物刺激MC 24 h后其培養(yǎng)上清液中NO?3NO?2濃度的變化Tab 1Concentration changes of NO?3NO?2 in culturesupernatant from MC stimulated for 24h with various doseof human C5b9 complexes(±s,n=4)C5b9 dose(g/mL)NO-3NO-2(molL)0(Control)11020*40*80*P0.05,*P0.01，vs control group 表2C5

16、b9復(fù)合物對MC生成NO-3NO-2的影響Tab 2Effect of C5b9 complex on NO-3NO-2 production from MC (±s, n=6)GroupNO-NO-(molL)6 h24 h48 hControlC5b9*L-NAMEC5b9+L-NAME*P0.05，*P0.01，vs control group；P0.05，P0.01, vs C5b9+L-NAME group 表3C5b9復(fù)合物對MC內(nèi)cGMP的影響Tab 3Effect C5b9 complex on cGMP level in MC（±s,n=6)GroupLe

17、vel of cGMP (pmolmg protein)24 h48 hControl380±121445±114C5b91043±513*851±316*L-NAME329±95328±91C5b9+L-NAME485±121537±220*P0.05，vs control group;P0.05,vs C5b9+L-NAME group 討論補(bǔ)體復(fù)合物是補(bǔ)體活化后最終形成的效應(yīng)單位。兔紅細(xì)胞表面缺乏C3b受體，它與異種血清接觸后可活化補(bǔ)體旁路途徑導(dǎo)致兔紅細(xì)胞溶解。利用這一特性通過生化手段能獲得較純的C5b9復(fù)合

18、物，這在本次實驗中得到證實。已知補(bǔ)體介導(dǎo)的反應(yīng)存在著同源限制性，即種屬相同的補(bǔ)體與細(xì)胞反應(yīng)時效率極低，這與細(xì)胞表面存在著同源限制因子(homologous restriction factor, HRF）有關(guān)7，本實驗用人血清C5b9復(fù)合物作用大鼠的腎小球MC，排除了HRF對補(bǔ)體刺激效應(yīng)的干擾。腎臟炎癥時，由于免疫復(fù)合物等因素可使補(bǔ)體激活最終形成攻膜成分即C5b9復(fù)合物而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。新近研究發(fā)現(xiàn)：系膜增生性腎炎具有補(bǔ)體依賴性8。腎小球系膜區(qū)C5b9復(fù)合物能夠作為MC的激活劑，刺激MC釋放多種介質(zhì)及細(xì)胞因子等，但并不造成細(xì)胞損傷，故有人將此C5b9稱為亞溶解劑量的C5b9復(fù)合物9。NO作為一種

19、親脂性分子，在腎細(xì)胞生理功能及病理反應(yīng)中起著一定的作用1。目前已知，腎小球細(xì)胞內(nèi)存在著兩種NO合酶（nitric oxide synthase,NOS)即結(jié)構(gòu)型NOS和誘生型NOS，后者在有刺激劑存在時，迅速催化底物合成NO。NO半衰期極短，在氧參與下生成二氧化氮，二氧化氮在液體中可轉(zhuǎn)變成NO-3和NO-2。另一方面，NO受體還與鳥苷酸環(huán)化酶相連，NO與其受體結(jié)合后可激活此酶，產(chǎn)生cGMP，導(dǎo)致胞內(nèi)cGMP含量升高。根據(jù)這一原理，本實驗以人C5b9復(fù)合物為刺激因子，利用NO產(chǎn)物NO-3NO-2和細(xì)胞內(nèi)cGMP含量作為檢測指標(biāo)，觀察其對大鼠腎MC產(chǎn)生NO的影響。結(jié)果表明，用C5b9復(fù)合物處理的M

20、C其培養(yǎng)上清液中NO-3NO-2含量在6 h時開始上升，24 h達(dá)到高峰，48 h時仍處于較高水平，與對照組相比有顯著差異，與C5b9L-NAME（NOS抑制劑）組相比也有明顯差別。此外，放射免疫測定表明，用C5b9復(fù)合物刺激培養(yǎng)的MC 24 h時細(xì)胞內(nèi)cGMP水平明顯上升；與對照組和C5b9加L-NAME組相比，差異均較顯著，在刺激48 h時后胞內(nèi)cGMP水平仍高于對照組。但與C5b9L-NAME組相比，差異已無顯著性。綜合實驗結(jié)果表明，一定劑量的C5b9復(fù)合物刺激能使大鼠腎MC合成的NO量增高。由于C5b9復(fù)合物插入細(xì)胞膜能介導(dǎo)多種信號傳遞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子如TNF-的釋放，而TNF

21、-也可促進(jìn)細(xì)胞合成NO2。本文已證實，C5b9復(fù)合物作為始動因素能誘導(dǎo)MC合成NO，但這一作用究竟是C5b9復(fù)合物的直接刺激還是細(xì)胞因子的間接效應(yīng)？還是兩者均有作用？仍有待進(jìn)一步研究。基金項目江蘇省及省衛(wèi)生廳自然科學(xué)基金資助王迎偉（江蘇徐州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 江蘇 徐州 221002）何球藻（上海醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，上海）秦慧蓮（上海醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，上海）湯仁仙（江蘇徐州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 江蘇 徐州 221002）高豐光（江蘇徐州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 江蘇 徐州 221002）張光毅（徐州醫(yī)學(xué)院生化教研室，江蘇 徐州）參考文獻(xiàn)1Klahr S. Renal disease:the

22、 two faces of nitric oxide J. Lab Invest,1995,72:13.2Raij L, Baylis C. Glomerular actions of nitric oxide J.Kidney Int,1995,48:2032.3Lovett DH, Haensch GM, Goppelt M,&127;et al.&127;Activation of glomerular mesangial cells by the terminal membrane attack complex of complement J. J Immunol, 1987,138(8):24732480.4王迎偉，何球藻. 補(bǔ)體C5b9復(fù)合物介導(dǎo)腎小球細(xì)胞炎性損傷的研 究進(jìn)展 J. 國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊，1999,22(2):7174.5Bhakdi S, Tranum-jensen J. T