三七總皂苷逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞MCF-7ADM多藥耐藥的實驗研究(一)

1、三七總皂苷逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞MCF-7/ADM多藥耐藥的實驗研究(一)    作者：劉麗麗， 劉艷娥，房國濤【摘要】 目的從中藥中尋找安全有效的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑,并初步研究三七總皂苷(PNS) 對人乳腺癌細胞MCF-7/S(敏感細胞) 及MCF-7/ADM(耐藥細胞) 的影響。方法以MTT 法測定PNS對MCF-7/S 及MCF-7/ADM的直接細胞毒作用；測定阿霉素(DOX) 對兩種細胞的毒性作用并計算出耐藥倍數(shù)；以無細胞毒性的三七總皂苷注射液作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑用MTT法體外藥敏感實驗觀察其對多藥耐藥細胞株MCF-7/ADM的逆轉(zhuǎn)作用；用RT-PCR分別測敏感細

2、胞和PNS作用后的耐藥細胞表達的MDR1基因的陽性率；用WESTERN測定敏感細胞和PNS作用后的耐藥細胞表達多藥耐藥蛋白P - gp (P - 170) 的陽性率。以上實驗均用維拉帕米作為陽性對照。結(jié)果PNS在300g/ ml 濃度以下時對兩細胞基本無毒性,為安全有效的逆轉(zhuǎn)劑量。阿霉素對敏感細胞和耐藥細胞的半數(shù)抑制濃度( IC50) 分別為0.62g/ ml 和25.03 g/ ml，耐藥倍數(shù)為40.37倍。PNS能夠增強阿霉素(DOX) 對MCF-7/ADM的細胞毒作用, PNS 50，100，200g/ ml分別作用于乳腺癌耐藥細胞48 h后，耐藥細胞株的IC50分別降至17.85，13

3、.80，11.63 g/ml。PNS(50，100，200g/ ml) 均可下調(diào)多藥耐藥基因mdr - 1 及其表達的糖蛋白P - gp 的量,且隨PNS濃度的增加，下調(diào)作用更加明顯。而未發(fā)現(xiàn)維拉帕米有類似作用。結(jié)論高濃度的三七總皂苷具有一定的抗腫瘤作用；三七總皂苷可下調(diào)MCF-7/ADM的MDR-1和P-gP；PNS能夠部分逆轉(zhuǎn)耐藥細胞MCF-7/ADM的多藥耐藥性；三七總皂苷是一種有效安全的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。 【關(guān)鍵詞】 乳腺癌 三七總皂苷 多藥耐藥 逆轉(zhuǎn) 體外研究Abstract：ObjectiveTo search a sort of safe and effective reversa

4、l agent for multidrug resistantce from Chinese traditional medicine and to study the impact of the Panaxnotoginseng saponins (PNS) on human breast clone MCF-7/S and multidrug resistance clone MCF-7/ADM in vitro. MethodsTo measure direct cell toxicant effect of PNS to MCF-7/S(sensitive strain) and MC

5、F-7/ADM (multidrug-resistant strain) and measure toxicant effect of dox to both strains for resistant index by MTT;to observe the reversal effect of PNS which has screened for nontoxicant concentration to MCF-7/ADM by MTT;to measure expression positive rate of mdr-1 and P-gp of the both cell after t

6、reatment with PNS by PCR and WESTERN .Veraparmil was used as a positive control.ResultsThere was no obvious cell toxicity of PNS to MCF-7/S and MCF-7/ADM cell,when the concentration of PNS was 300 g/ml below. IC50 of Dox to MCF-7/S and MCF-7/ADM were 0.62 ng/ml and 25.03 ng/ml respectively.Drug-Resi

7、stant index of MCF-7/ADM was 40.37.PNS could increase cell toxic effect of dox,after treated with could reduce manner 50，100，200 g/ml PNS respectively to MCF-7/ADM for 48 hours,IC50 respectively declined to 17.85，13.80，11.63 g/ml(P0.01);PNS(50，100，200g/ ml) could reduce the expression of mdr-1 and P

8、-GP. No significant effect was observed with verapmil.ConclusionHigh concentrationof PNS had certain tumor-resistant effect；PNS could reduce the expression of mdr-1 and P-GP of MCF/ADM ；PNS could partly revese multidrug-resistance of MCF-7/ADM in vitro；PNS can be a kind of safe and efficient reversa

9、l agent for clinic.Key words：Breast carcinoma; Panaxnotoginseng aponins; Multidrug resistance； Reversal; Research in vitro乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，占女性腫瘤發(fā)病率的第二位，乳腺癌是實體瘤中應(yīng)用化療最有效的腫瘤之一，化療在整個治療中占重要的地位，但由于多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生而導(dǎo)致化療失敗并由此引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，限制了許多抗癌藥(特別是植物類)的臨床應(yīng)用1。MDR的主要機制之一是細胞過量表達了一種膜P糖蛋白(P·glycoproteinPGP，分子量l7018

10、0KD)，它通過消耗ATP將藥物從細胞內(nèi)快速 “泵出”細胞，致細胞內(nèi)藥物聚集減少，產(chǎn)生耐藥2。研究表明許多非化療藥物如異博定、三氟拉嗪等都能逆轉(zhuǎn)抗癌藥物的耐藥，其主要機制是使MDR細胞“藥物外排”系統(tǒng)失活，細胞內(nèi)聚集的藥物總量增加。從而提高抗癌藥物的藥理效應(yīng)，但這些逆轉(zhuǎn)劑對機體副作用較大，影響臨床推廣應(yīng)用 。目前，許多研究室都致力于研制和開發(fā)低毒、高效的逆轉(zhuǎn)藥物，本實驗從中藥寶庫中篩選的PNS經(jīng)體外研究證實其能夠逆轉(zhuǎn)耐ADM 人乳腺癌細胞MCF-7/ADM 對ADM的耐藥 。為進一步闡明PNS的作用機制，本文應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，從蛋白質(zhì)和RNA水平對其逆轉(zhuǎn)機制進行了探討。1 材料1.1 細

11、胞株人乳腺癌細胞株MCF-7/S由大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院中心實驗室提供，具有多藥耐藥表型的耐阿霉素細胞株MCF - 7/ ADM購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液學(xué)研究所。1.2 藥物及試劑主要試劑：阿霉素(Adriamycin) (意大利法瑪西亞普強公司)。阿霉素用生理鹽水配成10 mmol/ L 的工作母液, 三七先用DMSO溶解,然后用生理鹽水配成10 mmol/ L 的工作母液,使用時用DMEM培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度應(yīng)用液。工作母液分裝后,避光保存于4 冰箱，鼠抗人P-gp單克隆抗體、生物素標記的抗體（二抗）、辣根過氧化物酶標記的卵白素（酶）均購于北京中杉生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑盒（美國I

12、nvitrogen公司），RT-PCR試劑盒，DNA Marker，6X Loading Buffer，低熔點瓊脂糖、MDR1，MRP基因及2微球蛋白（2-MG）PCR引物均購于大連寶生物工程有限公司。2 方法2.1 細胞培養(yǎng)敏感細胞株MCF - 7/ S 于含10 %小牛血清、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液中，在37 、飽和濕度及5 %的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。相應(yīng)耐藥株MCF - 7/ ADM連續(xù)培養(yǎng)在含1. 0 mg·L-1阿霉素(ADM) 的上述培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件相同。MCF-7/ ADM耐藥細胞實驗前兩周無

13、藥培養(yǎng)，取對數(shù)生長的兩種細胞株進行實驗。2.2 步驟2.2.1 MTT法測定無或低細胞毒作用的PNS濃度實驗分MCF-7/S + PNS，MCF-7/ADM+ PNS，MCF-7/S + Ver，MCF-7/ADM+ Ver 組，取對數(shù)生長的MCF-7/S，MCF-7/ADM細胞懸液100 l 分別接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)均為105/ 孔，然后加入不同濃度的PNS 溶液(先用DMSO溶解,然后用生理鹽水配成10 mmol/ L 的工作母液，使用時用DMEM培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度應(yīng)用液) ，使PNS 濃度分別為0，10，100，500，1 000 g/ ml ,加入Ver 并使之濃度分別為

14、0，0.1，1，5，10 g/ ml，實驗均設(shè)3個復(fù)孔, 置于37 ，5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h 后加入MTT 20 l ，作用4 h 后平板離心機1 000 r/min 離心，棄去上清液，加入DMSO 100 l ，微量振蕩10 min ,酶標儀檢測波長570 nm 時OD值(吸光度) 。計算PNS 和Ver 的IC50 (半數(shù)抑制量) 值。2.2.2 用MTT法測定MCF-7/ADM耐藥細胞株對DOX，VCR 的耐藥倍數(shù)(耐藥細胞IC50/ 敏感細胞IC50)實驗分MCF-7/S +DOX ，MCF-7/ADM+DOX ，MCF-7/S + VCR ，MCF-7/ADM+ VCR

15、組，取不同濃度的DOX和VCR濃度。具體方法同(1) 。分別計算DOX，VCR 對耐藥細胞的IC50值和耐藥細胞的耐藥倍數(shù)(耐藥細胞IC50/ 敏感細胞IC50) 。2.2.3 測定PNS 對 MCF-7/ADM 耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用實驗分 MCF-7/ADM + DOX，MCF-7/ADM + PNS (3 個濃度) + DOX、MCF-7/ADM+ Ver + DOX組,PNS 取第一步篩選的無細胞毒性濃度分別為50，100，200 g/ ml ，每個濃度設(shè)3 個復(fù)孔，Ver 取1g/ ml (無細胞毒性,細胞存活率98 %以上) ，設(shè)3個復(fù)孔。DOX 濃度取0，0.1，1，10，100 g

16、/ ml 。余法同(1) 。計算DOX對MCF-7/S的IC50并計算PNS 和Ver 的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(逆轉(zhuǎn)前IC50/ 逆轉(zhuǎn)后IC50) ，每次實驗重復(fù)3次。2.2.4 PCR儀測定MDR-1基因表達取數(shù)生長期的MCF-7/S和MCF-7/ADM細胞接種于六孔板中，其中1孔為陰性對照MCF-7/S，1孔為MCF-7/ADM陽性對照，1孔為MCF-7/ADM+ Ver (5 g/ml)，其余3孔待貼壁后分別加入終濃度為50， 100，200 g/ ml的PNS+MCF-7/ADM培養(yǎng)48 h后，取滅菌后無Rnase的小離心管，采用Trlzol試劑提取各組總RNA，經(jīng)AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)合成cDNA

17、。逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)構(gòu)成如下：MgCl2 2l，10 ×RNA PCR Buffer 1 ，dNTP mixture 1，Rnase 0.25，反轉(zhuǎn)錄酶0.5，Random 9mers 0.5 l總RNA 1 g，DEPC水4 l，共10 l，反應(yīng)條件為 30 10 min，42 1h,99 5min,5 5min。PCR 反應(yīng)系統(tǒng)構(gòu)成如下: 在10 l的cDNA產(chǎn)物中加入MgC123 l，10 x LC PCR Buffer4 l、Taq 酶0.25 l 、MDR1引物、2-MG引物（上下游引物均為0.5 l）、蒸餾水30.75 l，反應(yīng)體系50 l，混勻后離心數(shù)秒。引物序列: MDR-1

18、：上游5' - CCCATCATTGCAATAGCAGG- 3' ； 下游5' - GTTCAAACTTCTGCTCCTGA- 3'； 擴增產(chǎn)物157 bp。2-MG：上游 5' - ACCCCCACTGAAAAAGATGA- 3' ； 5' - ATCTTCAAACCTCCATGATG- 3' ，擴增產(chǎn)物120 bp。擴增條件: 94預(yù)變性2 min, 進入循環(huán)94 30 s, 55 30 s, 72 60 s, 共35個循環(huán), 最后72延伸10 min。取10 l PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳分離, 溴化乙錠染色，實驗重復(fù)

19、3 次，UVP 凝膠成像系統(tǒng)掃描, 并用Gelbase電腦軟件進行光密度分析， 以MDR1與2-MG的RT- PCR 產(chǎn)物吸光度比值作為MDR1 mRNA 的相對含量。2.2.5 Wesrern blotting檢測P-gp的表達取上述的各組細胞（每組細胞約1×108個）, 每組加入200 l 細胞裂解液( 50 mmol /L Tris - HCl pH8.0，150 mmol /L NaCl，5 mmol /L EDTA、1%triton X- 100、1 mmol PMSF) ,冰浴上超聲粉碎, 4離心7 min( 11 000 r/min) , 取出上清液（蛋白）, 分光光度

20、計下測量樣品的純度，計算濃度及100 g蛋白所需的樣品的容積數(shù)。取蛋白樣品各100 g 上樣, 經(jīng)SDS- PAGE 電泳進行蛋白轉(zhuǎn)膜, 加入5%脫脂奶粉封阻90 min, 加入一抗P-gp （1160）4過夜，TTBS洗膜15min X 3次，加二抗3740 min，TTBS洗膜15 min×3次，加辣根過氧化物酶3740 min，TTBS洗膜15 min×3次，DAB顯色。實驗重復(fù)3 次，UVP 凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，比較各條帶的吸光度值。2.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用±s表示，采用 SPSS 12.0 軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗，P0.05 為統(tǒng)計學(xué)檢驗有顯著性差

21、異。3 結(jié)果3.1 PNS 和Ver 對MCF-7/S，MCF-7/ADM的細胞毒性PNS 對MCF-7/S，MCF-7/ADM 的細胞毒性很小,其在300 g/ ml 濃度以下時對兩組細胞基本無毒性，細胞存活率均在98 %以上，500 g/ml 以上隨著濃度的增大其細胞毒性作用明顯增加。Ver 在7 g/ ml 以上時具有明顯的細胞毒性作用，且毒性作用與其濃度呈正相關(guān)。PNS 和Ver 分別對兩種細胞的IC50無明顯差別( P>0.05) 。結(jié)果見表1。3.2 MCF-7/S對化療藥物VCR，DOX的耐藥倍數(shù)見表1。表1 DOX，VCR，PNS和Ver對MCF-7/S和MCF-7/AD

22、M的IC50值（略）3.3 PNS 對MCF-7/S耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用見表2。不同濃度的PNS能不同程度地增強ADM 對MCF-7/ADM細胞的殺傷作用，提高細胞對ADM的敏感性，表現(xiàn)為IC50下降，對ADM 的敏感性提高至原來的1.42.1倍，但仍遠高于敏感株MCF-7/S的IC50(0.62±0.03) g/ ml，說明PNS能降低MCF-7/ADM細胞對ADM 的抗性，并具有一定的協(xié)同作用，且作用強度與PNS的劑量呈正相關(guān)。表2 加入Ver和不同濃度的PNS對DOX作用于耐藥細胞的影響（略）3.4 PNS 對 MCF-7/ADM表達MDR-1的影響結(jié)果見圖12及及表3。表3 P

23、NS和VER對MCF-7/ADM細胞MDR1 mRNA和P- gp蛋白表達的影響（略4 討論腫瘤細胞的多藥耐藥性（MDR）是指腫瘤細胞對一種藥物耐藥的同時，對其他結(jié)構(gòu)和作用機制不同的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。多藥耐藥性是腫瘤諸多惡性表現(xiàn)之一，是多基因、多階段、多步驟和多因素作用的結(jié)果，其發(fā)生機制很復(fù)雜，受各種內(nèi)源性和外源性因素的影響，其中膜糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排機制是其重要機制之一。P-糖蛋白( P-gp)是最具有代表性也是近幾年研究最多最清楚的膜糖蛋白。P-糖蛋白( P-gp)是定位于人染色體7q21.1上的MDR-1基因編碼的一種跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量為170 000 。它屬于ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運

24、蛋白超家族成員之一，由兩個同源部分組成，每個部分都包含6個疏水跨膜區(qū)和1個具有高度保守A TP 結(jié)合位點的親水區(qū)，親水區(qū)可能含有2個核苷酸結(jié)合位點，而疏水區(qū)則含有多個與MDR 有關(guān)的藥物結(jié)合位點3，P-gp主要定位在細胞膜，在胞質(zhì)內(nèi)也可見其定位于高爾基復(fù)合體和溶酶體形成的小泡4?！八幬锬け谩奔僬f認為P-gp是細胞膜上的一種藥物泵，利用水解ATP產(chǎn)生的能量，P-gp可將進入細胞內(nèi)的藥物泵出，降低細胞內(nèi)的藥物濃度，減少藥物對腫瘤的殺傷作用，引起腫瘤細胞對藥物的耐受，從而產(chǎn)生MDR。阿霉素 PNS 維拉帕米 單位均為g/ ml，所在組 PNS( Panaxnotoginseng saponins ,

25、 PNS) 是從中藥三七中提取出的一組有效成分，具有活血化瘀和補益作用，來源豐富，價格便宜,毒副作用小。長期以來，補益中藥以及活血化瘀中藥的增敏作用已經(jīng)得到充分證實，大多數(shù)學(xué)者認為目前具有增敏活性的某些藥物可能具有潛在的逆轉(zhuǎn)MDR 的活性。史亦謙等5已報道PNS具有逆轉(zhuǎn)白血病MDR 的效應(yīng)，但對其他腫瘤的耐藥逆轉(zhuǎn)尚未有報道，為了證實其是否對乳腺癌耐藥也有逆轉(zhuǎn)效果，而開展了本項研究。本文采用MCF-7/ADR 為靶細胞進行了逆轉(zhuǎn)研究，并用維拉帕米作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)PNS 在50300 g/ ml 的無細胞毒性范圍內(nèi)能夠提高DOX 對耐藥細胞的細胞毒作用，而且隨著藥物濃度的增加其逆轉(zhuǎn)作用逐漸增強,與Ver 比較，PNS 在200 g/ ml 濃度時其逆轉(zhuǎn)強度明顯大于Ver 1 g/ ml 濃度時的逆轉(zhuǎn)強度。通過PT-PCR和Western的檢測發(fā)現(xiàn)PNS 能夠部分下調(diào)多藥耐藥基因MDR-1 及其表達的P-170 糖蛋白。這可能為其機制，而維拉帕米不影響MDR