Toll樣受體4在乙型肝炎組織及細胞株 HepG2HepG2.2.15內(nèi)的表達特征

1、                 作者：郭云蔚， 尉秀清， 李永偉， 楊紹基【摘要】  【目的】 探討Toll樣受體4（TLR4）在乙型肝炎組織及細胞株HepG2/HepG2.2.15內(nèi)的表達特征?！痉椒ā?采用免疫組化染色法檢測慢性乙型病毒性肝炎(CHB)63例、慢性重型肝炎(CSH)11例及健康對照組10例肝組織TLR4的表達，綜合評分法判斷結(jié)果。常規(guī)培養(yǎng)肝癌細胞株HepG2及HepG2.2.15，采用直接免疫熒光流式細胞術(shù)(FCM

2、)檢測TLR4在細胞上表達的平均熒光強度(MFI)及陽性細胞率?！窘Y(jié)果】 TLR4在慢性乙型病毒性肝炎及慢性重型肝炎患者肝組織上的表達明顯高于健康對照組（P 0.01），主要表達于肝細胞胞漿及部分胞膜，在慢性乙型病毒性肝炎中，TLR4的表達強度與肝組織炎癥活動度分級(G) 呈顯著正相關(guān)(r=0.632，P0.001)。TLR4在肝癌細胞株HepG2.2.15上表達的平均熒光強度及陽性細胞率分別為18.24 ± 8.18、(17.79 ± 9.46)%，明顯高于HepG2的2.33 ± 0.41、(1.71 ± 0.77)%（P 0.001）。 【結(jié)論】

3、TLR4的表達與乙型病毒性肝炎肝組織的炎癥活動密切相關(guān)，而乙型肝炎病毒可直接上調(diào)細胞TLR4的表達，故TLR4參與了乙型病毒性肝炎發(fā)病過程中的免疫反應并極有可能與免疫損傷有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  TLR4； 乙型病毒性肝炎； 免疫組化； 流式細胞術(shù)   J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):284-287   目前認為，乙型肝炎病毒侵入人體后，免疫介導的肝損傷是乙型病毒性肝炎發(fā)病的主要機制。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR），是近年來發(fā)現(xiàn)的I型跨膜蛋白質(zhì)，已有10余個家族成員，

4、它可通過識別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引發(fā)信號傳導導致炎癥介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)1。部分研究顯示，TLR4等在某些病毒感染的疾病過程中有重要作用。本研究通過檢測乙型病毒性肝炎患者肝組織，肝癌細胞株HepG2和HepG2.2.15細胞TLR4的表達，探討TLR4與乙型病毒性肝炎的相關(guān)性。    1   材料和方法   1.1   研究對象   標本取自2003年

5、6月至2006年2月中山大學附屬第三醫(yī)院部分住院病人共74例，男性69例，女性5例，平均年齡36（1652）歲，其中慢性乙型病毒性肝炎組(chronic viral hepatitis B,CHB)為肝穿刺標本，共63例，慢性重型肝炎組（chronic severe hepatitis ,CSH，乙型）為肝移植病肝切除標本，11例。另設(shè)健康對照組，標本取自肝移植移植肝常規(guī)留取標本，10例。均行常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片。診斷符合2005年慢性乙型肝炎防治指南及2000年病毒性肝炎防治方案3，4。   1.2   方法   1.2.1

6、0;  肝組織病理切片的TLR4表達檢測   采用Elivision二步法進行免疫組化染色（Elivision二步法試劑盒購自福州邁新公司），具體步驟參照試劑盒推薦步驟進行，一抗為anti-TLR4 PcAb（兔源性，美國Santa Cruz公司），稀釋度為1 100，DAB顯色，用檸檬酸高溫高壓法進行抗原修復，設(shè)立陰性對照，以PBS代替一抗。   1.2.2   診斷方法   所有病理切片均行HE、網(wǎng)狀纖維染色及HBsAg、HBeAg免疫組化染色（SABC法）以輔助慢性乙型肝炎肝組織炎癥活動度的分級(G

7、)、纖維化程度的分期(S)的診斷，診斷標準參照2000年病毒性肝炎防治方案。   1.2.3   免疫組化結(jié)果的判斷   采用綜合評分法（由研究者及1名病理師分別閱片評分）。陽性著色呈棕色細顆粒狀。凡細胞質(zhì)或細胞核淺棕色為1分、棕色為2分、深棕色為3分、不著色為0分；在高倍鏡下隨機計數(shù)5個視野，計算陽性細胞所占百分比，陽性細胞占所有細胞的比例：10%為0分，11%25%為1分，26%50%為2分，51%75%為3分，76%為4分。根據(jù)上述2項指標的兩積分相乘分為4級：0分為陰性(-)、14分為弱陽性(+)、58分為中等陽性(+)、91

8、2分為強陽性(+)。   1.2.4  細胞培養(yǎng)   肝癌細胞株HepG2及HepG2.2.15（中山大學附屬第三醫(yī)院傳染科實驗室保存）培養(yǎng)液為含10%滅活新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司），HepG2.2.15細胞培養(yǎng)液另加G418，細胞常規(guī)培養(yǎng)傳代，然后取對數(shù)生長細胞以104/mL接種于6孔板中，至細胞貼壁融合90%以上時每株各取4孔消化收集細胞，進行TLR4表達檢測，以上實驗重復2次。   1.2.5   培養(yǎng)細胞的TLR4表達檢測   采用直接免疫熒光流式細胞術(shù)。2種

9、細胞株各收集4管，DMEM懸浮細胞，15 × 106/mL。檢測前PBS洗滌細胞，分別加入PE-anti-TLR4抗體（美國Ebioscience公司）10 L和細胞100 L，設(shè)同型對照，以PE-mouse IgG 2a（美國Ebioscience公司）10 L代替PE-anti-TLR4抗體，震蕩充分混勻，按常規(guī)方法室溫、避光孵育20 min。以PBS常溫1000 g離心5 min洗滌 1次后，以PBS配成約106/mL液，用FCM及Cellquest軟件檢測并分析TLR4的平均熒光強度及陽性細胞率（采用BD FACS Calibur 流式細胞儀）。以上實驗重復2次。 

10、  1.3   統(tǒng)計學分析   使用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析，各組間的多重比較采用列聯(lián)表分析，兩組間計量資料采用t檢驗，取?琢=0.05。   2   結(jié)   果   2.1   TLR4在慢性乙型病毒性肝炎患者肝組織上的表達   TLR4在CHB肝組織上主要表達于肝細胞胞漿及部分胞膜上，細胞核及匯管區(qū)無表達，與健康對照組相比，TLR4的表達明顯增強（P 0.01，見圖1AC），免疫

11、組化染色強度與肝組織炎癥活動度的分級(G)呈顯著正相關(guān)(r=0.632，P 0.001)，除G3組與G4組之間無顯著性差異外，余各G組之間均有顯著性差異，見表1。   2.2   TLR4在慢性重型肝炎肝組織上的表達   TLR4在CSH肝組織上主要呈小灶性表達，大片壞死區(qū)基本無表達，與健康對照組相比，TLR4的表達明顯增強（P 0.05，圖1D），但低于CHB組G2、G3、G4級的表達（P 0.05），與G1級的表達無顯著性差異。        

12、60;  2.3   TLR4在CHB肝組織上的表達與其他臨床指標的關(guān)系   TLR4在CHB肝組織上的表達與其他臨床指標，包括纖維化程度的分期(S)，肝組織HBsAg、HBeAg免疫組化染色強度、血HBV-DNA定量，AST、ALT、ALB、TBILI、PT等肝功能指標均無顯著性關(guān)系（r=0.0330.273，均為P 0.05）。   TLR4在肝癌細胞株HepG2.2.15上表達的平均熒光強度為18.24±8.18（n=12），明顯高于在肝癌細胞株HepG2上表達的平均熒光強度2.33 ± 0.41（

13、n=12，t=6.729，P 0.001）；而TLR4+的陽性細胞率，在HepG2.2.15上為（17.79 ± 9.46）%，亦明顯高于HepG2的陽性細胞率（1.71 ± 0.77）% （t=5.870，P 0.001）。    3   討   論   目前所知，免疫介導的肝損傷是慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病的主要機制，HBV感染后，細胞毒性T細胞（Tc）、輔助性T細胞（Th）、庫普弗細胞、自然殺傷細胞等各種免疫細胞均被激活，釋放TNF（tumor necrosis factor ）、I

14、FN（interferon ）、IL-2（interleukin-2）、IL-6（interleukin-6）等細胞因子，從而對肝臟造成損傷，故研究免疫損傷的具體機制及尋找有效且副作用小的免疫治療方法一直是慢性乙型肝炎治療的熱點及難點。   TLR是連接天然免疫及獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁1，其中TLR4是該家族中目前研究得較清楚的成員，它主要表達在巨嗜細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及內(nèi)皮細胞上，它識別PAMPs或相關(guān)內(nèi)源性配體后，通過髓樣分化因子88依賴性信號傳導途徑（MyD88），可引起細胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF及IFN等的合成與釋放，促使免

15、疫細胞成熟、分化和功能化，并在部分研究中提示TLR4能促進機體對病毒的清除。   正常肝臟是人體各組織中表達TLR最低的器官之一，新近細胞研究顯示，某些炎癥或前炎性因子如細菌脂多肽、IL-la、TGF-可以上調(diào)肝細胞TLR表達。在與病毒性肝炎相關(guān)性的研究中，Machida等的研究發(fā)現(xiàn)，在感染HCV的Raji細胞系中，TLR4的表達有明顯的升高，而在感染HCV的患者外周血單個核細胞中，TLR2及TLR4均有明顯的升高，并認為HCV感染后B細胞分泌IL-6及TNF的能力明顯加強，這一功能是由TLR4介導的。Mozer-Lisewska等對感染HCV的兒童患者的研究中發(fā)現(xiàn)，病肝組

16、織上有TLR2及TLR4的表達，而正常肝組織則無，認為TLR在兒童丙型病毒性肝炎免疫清除及損傷中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，給轉(zhuǎn)基因小鼠注射TLR配體，可抑制HBV的復制。Duesberg等在對HCV疫苗的研究中，發(fā)現(xiàn)HCV的T細胞抗原決定表位與脂多肽結(jié)合，是有效的免疫刺激劑，而這一作用是由TLR2、TLR4介導的。至于TLR與乙型病毒性肝炎的關(guān)系如何，目前尚不清楚。   我們的研究顯示，TLR4在健康肝中基本不表達或僅有輕度表達，而在慢性乙型病毒性肝炎及慢性重型肝炎肝組織中，TLR4的表達明顯升高，主要表達于肝細胞胞漿及部分胞膜，與Mozer-Lisewska等關(guān)于兒童丙型病

17、毒性肝炎的研究基本一致。另外，在慢性乙型病毒性肝炎中，隨著肝組織炎癥活動度分級(G)的升高，TLR4的表達有升高的趨勢。故我們認為，TLR4作為可對微生物病原體直接做出防御反應同時誘發(fā)繼發(fā)免疫反應的受體之一，參與了慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病過程的免疫反應，并且這種參與較傾向于免疫介導的肝損傷。慢性重型肝炎肝組織TLR4的表達強度低于慢性乙型病毒性肝炎組G24級，與G1級相當?shù)脑颍赡芘c重型肝炎存在較多的壞死區(qū)，導致有功能的肝細胞大量減少且活性降低，進而合成TLR4分子的能力下降有關(guān)。為了進一步了解乙型肝炎病毒本身與TLR4表達的關(guān)系，我們進行了細胞實驗。HepG2.2.15細胞株是由HepG2細

18、胞株轉(zhuǎn)染了乙型肝炎全病毒形成，實驗結(jié)果表明，TLR4在HepG2.2.15細胞上表達的平均熒光強度和陽性細胞率均明顯高于HepG2，故可推測乙型肝炎病毒能直接上調(diào)細胞TLR4的表達。   由此可知，TLR4與乙型病毒性肝炎的關(guān)系密切并且可能在病毒性肝炎的免疫損傷中起較重要作用。但是，乙型肝炎病毒是通過何種途徑上調(diào)TLR4的表達，TLR4又是如何引起免疫細胞的聚集成熟，刺激細胞因子的釋放，具體機制均需進一步研究，而調(diào)節(jié)或干擾TLR4信號途徑，是否有望成為較為有效的病毒性肝炎的免疫治療方法，有待進一步證實。【參考文獻】  MEDZHITOV R, PRESTON-HU

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