水通道蛋白-4

1、    水通道蛋白-4    畢業(yè)論文    1 水通道蛋白-4 與血腦屏障發(fā)育及其完整性的關(guān)系 鄭躍英 祝勝美 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第1醫(yī)院麻醉科 水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是介導(dǎo)水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的1大膜蛋白家族,分布于高等脊椎動(dòng)物上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞.結(jié)構(gòu)上由28-KDa亞單位組成4聚體,每個(gè)亞單位構(gòu)成孔徑約0.38nm的水孔通道,在滲透壓驅(qū)動(dòng)下實(shí)現(xiàn)水雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)【1】.目前11種亞型已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中被確定(AQP0-10),各種亞型的體內(nèi)分布具有組織特異性,其中

2、水通道蛋白-4 (Aquaporin 4,AQP4)以極化形式集中分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦毛細(xì)血管周邊的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突或室管膜細(xì)胞【2】. 血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)為腦內(nèi)另1調(diào)控水平衡的復(fù)合體,由無(wú)窗孔的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接,基底膜,星形膠質(zhì)細(xì)胞等組成,介于血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)之間,限制血液中某些離子,大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移到腦實(shí)質(zhì),此屏障作用為維持CNS內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,保障腦功能正常行使提供了重要保障.BBB分化發(fā)育過(guò)程中腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的形成雖被認(rèn)為是其成熟的標(biāo)志,但BBB生理功能的實(shí)現(xiàn)有

3、賴于各組成成分間的相互作用.近來(lái)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控BBB物質(zhì)交換和腦內(nèi)水平衡方面的作用日益受到重視,并認(rèn)為與AQP4表達(dá)有關(guān). 本文就AQP4與血腦屏障發(fā)育及其完整性關(guān)系的研究進(jìn)展作1中華麻醉在線 2007年9月2 綜述. 1.BBB分化發(fā)育過(guò)程中AQP4的表達(dá) 目前由于對(duì)雞胚視頂蓋中血管及BBB分化的研究已較完善,因此常被用于BBB的研究模型.Nico及其同事【3】采用免疫細(xì)胞化學(xué),分子生物學(xué)技術(shù)研究了雞胚視頂蓋AQP4在BBB分化發(fā)育過(guò)程的動(dòng)態(tài)表達(dá).免疫電鏡顯示雞胚視頂蓋發(fā)育第9 d,BBB僅由不規(guī)則的內(nèi)皮細(xì)胞組成,內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接尚未形成,AQP4未見(jiàn)表達(dá).待發(fā)育至第14 d,West

4、ern blot 技術(shù)首次在約30 kDa鏈附近檢測(cè)出AQP4的免疫活性,電鏡下顯示短的內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接已形成,并串聯(lián)構(gòu)成BBB的微血管,星形膠質(zhì)細(xì)胞間斷黏附于血管壁,AQP4不連續(xù)地表達(dá)于血管周邊,血管周?chē)匀淮嬖谛】障?發(fā)育第20 d BBB成熟,內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接形成,BBB微血管被星形膠質(zhì)細(xì)胞緊緊包被,血管周邊星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上的AQP4呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),且冷凍斷裂研究顯示AQP4的正交排列陣也同步形成.而在嚙齒類(lèi)動(dòng)物,BBB分化發(fā)育發(fā)生于出生后,AQP4表達(dá)與BBB發(fā)育也表現(xiàn)出1定的同步性.大鼠出生后腦毛細(xì)血管呈最大速率增殖,BBB逐步發(fā)育完全,腦內(nèi)AQP4的首次檢出也恰在出生后(生

5、后第7 d的小腦內(nèi)),且隨BBB分化發(fā)育逐漸增加【4】. 以上證據(jù)顯示不論BBB于胚胎期發(fā)育完全的禽類(lèi)還是出生后發(fā)育完全的嚙齒類(lèi)動(dòng)物,AQP4表達(dá)與BBB分化發(fā)育都表現(xiàn)出1定意義的同步性,說(shuō)明腦內(nèi)水調(diào)控與血腦屏障關(guān)系密切. 2.AQP4在BBB發(fā)育過(guò)程中的作用 3 水通道蛋白的表達(dá)與BBB生理功能間的聯(lián)系在胚腦發(fā)育過(guò)程中得到了很好地體現(xiàn).嚙齒類(lèi)動(dòng)物胚腦發(fā)育之初,巨大的細(xì)胞外間隙(ECS)容納著大量水和離子,僅通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散將其轉(zhuǎn)移入血液,ECS容積改變不明顯.隨著B(niǎo)BB分化發(fā)育,膠質(zhì)細(xì)胞在腦毛細(xì)血管外層被膜形成,AQP4表達(dá)增多,待到腦發(fā)育后期BBB分化發(fā)育成熟時(shí),ECS內(nèi)水及離子得以高效轉(zhuǎn)運(yùn),

6、ECS容積迅速減小,完成了腦的最后發(fā)育【4】. 為進(jìn)1步揭示AQP4在BBB發(fā)育過(guò)程中的作用,研究者【3】采用脂多糖(LPS)破壞發(fā)育20 d的雞胚視頂蓋(即發(fā)育成熟的BBB)以模擬腦膜腦炎時(shí)的病理病變.受LPS影響電鏡下BBB形態(tài)發(fā)生明顯改變,內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接被分開(kāi),血管周邊星形膠質(zhì)細(xì)胞足突明顯水腫,AQP4免疫反應(yīng)活性變微弱且呈間斷分布,表明BBB受損時(shí)AQP4也發(fā)生相應(yīng)改變,AQP4是腦水腫發(fā)生的關(guān)鍵因素,且BBB與調(diào)控水流的AQP4關(guān)系密切. 3.mdx和mdx3cv模型中BBB結(jié)構(gòu)和AQP4表達(dá)的變化 mdx模型模擬了人類(lèi)Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD).此病為X性連鎖隱性

7、遺傳性肌病,由于編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的DMD基因缺陷(缺失或突變),肌細(xì)胞內(nèi)缺乏dystrophin,導(dǎo)致肌纖維膜細(xì)胞骨架功能缺失,產(chǎn)生對(duì)稱(chēng)性肌無(wú)力,肌萎縮為主要特征的臨床癥狀【5】.近年來(lái)該病的細(xì)胞膜學(xué)說(shuō)得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同,即肌細(xì)胞遺傳性某種代謝缺陷使肌纖維膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,因此細(xì)胞膜尤其是膜蛋白的研究成為DMD膜假說(shuō)的重要手段.研究顯示mdx小鼠4 肌纖維膜上AQP4蛋白呈年齡相關(guān)性下調(diào),1歲齡成年mdx小鼠較年齡相仿的野生型小鼠AQP4表達(dá)下調(diào)90%以上【6】,腦內(nèi)AQP4的表達(dá)也呈現(xiàn)與年齡相關(guān)的下調(diào),同時(shí)DMD患者的肌組織活檢也顯示AQP4表達(dá)下調(diào)的結(jié)果【7】,

8、因此目前認(rèn)為AQP4表達(dá)的改變涉及DMD的發(fā)病,mdx模型也因此被用于AQP4的研究. Nico等【2】研究顯示dystrophin 表達(dá)缺陷的18-20個(gè)月齡的mdx小鼠BBB形態(tài)改變明顯,內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接斷裂,細(xì)胞旁及細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)增加,血管周?chē)切文z質(zhì)細(xì)胞水腫,AQP4表達(dá)下調(diào),BBB滲透性增加,血管源性水腫形成.進(jìn)1步研究顯示BBB改變始于mdx小鼠出生前,即肌肉病理特征尚未表現(xiàn)時(shí),表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞胞膜的細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1下調(diào)并移位至胞漿,影響細(xì)胞間緊密連接的形成,GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的1種標(biāo)志物)下調(diào),星形膠質(zhì)細(xì)胞減少,AQP4表達(dá)也下調(diào),血管滲透性增加【8】.mdx模

9、型說(shuō)明BBB完整性和星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控水轉(zhuǎn)運(yùn)的作用密切相關(guān),同時(shí)也說(shuō)明腦內(nèi)AQP4的定位有賴于dystrophin蛋白.腦內(nèi)dystrophin蛋白包括DP140,DP71及長(zhǎng)鏈dystrophin DP427,以DP71為主.由于mdx模型并不影響DP71表達(dá),遂采用敲除DP71的mdx3cv模型進(jìn)1步研究.mdx3cv模型中2月齡小鼠即出現(xiàn)AQP4表達(dá)下調(diào),較mdx小鼠提前出現(xiàn).免疫組化顯示mdx3cv小鼠腦皮質(zhì)血管周?chē)拇罅啃切文z質(zhì)細(xì)胞足突甚至沒(méi)有AQP4染色,免疫金結(jié)果進(jìn)1步明確顯示腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突出現(xiàn)極少的AQP4金顆粒,且少量AQP4金顆粒移位至神經(jīng)纖維周邊的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜.A

10、QP4在mdx3cv小鼠模型的表達(dá)改5 變也說(shuō)明DP71對(duì)其在腦內(nèi)的準(zhǔn)確,穩(wěn)定定位起關(guān)鍵作用. 4.AQP4與BBB完整性的關(guān)系 DMD,顱腦機(jī)械損傷,神經(jīng)系統(tǒng)損傷,化膿性腦病,顱腦腫瘤,永久性腦缺血或短暫性腦缺血再灌注損傷等病變多伴有BBB損傷,腦血管滲透性增加及血管源性水腫,而AQP4在其中的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)不1【9,10,11,12】,以致難以明確AQP4上調(diào)或下調(diào)與水腫形成或消退的關(guān)系.AQP4上調(diào)是引起水腫的早期原因抑或是水腫發(fā)生后促進(jìn)水腫液排出的反應(yīng),AQP4下調(diào)阻止了水腫液清除而致水腫抑或是AQP4下調(diào)是抑制水腫惡化的機(jī)體防御反應(yīng) mdx,mdx3cv小鼠AQP4表達(dá)下調(diào)同時(shí)血管周

11、邊星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫【13】,說(shuō)明生理情況下AQP4下調(diào)可能促進(jìn)水腫形成.水中毒情況下,敲除AQP4基因模型及mdx模型較野生型動(dòng)物更易抑制腦水腫形成【13,14,15】,說(shuō)明水中毒病理情況下AQP4下調(diào)可能抑制腦水腫形成.病理和生理情況下滲透梯度的改變或許可以解釋AQP4此截然相反的作用.生理情況下,由于AQP4與內(nèi)在整流性K+通道(Kir 4.1)共定位,使腦實(shí)質(zhì)內(nèi)水及神經(jīng)元放電活動(dòng)釋放出的K+被及時(shí)清除入血流,確保神經(jīng)信號(hào)的正常傳導(dǎo)和腦內(nèi)環(huán)境的滲透平衡【13,16】,因此認(rèn)為生理情況下水通過(guò)AQP4從腦實(shí)質(zhì)流向血液,而AQP4缺乏或減少則阻礙水正常清除導(dǎo)致腦水腫.相反,在腦水平衡失調(diào)的病理

12、情況下,腦內(nèi)水從血流反向流入腦實(shí)質(zhì),AQP4上調(diào)則促進(jìn)腦水腫形成,抑制其表達(dá)則抑制水腫形成. 5. AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中的表達(dá) 6 細(xì)胞培養(yǎng)是膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用體外研究的良好工具【17,18】.免疫熒光分析顯示AQP4主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞離體培養(yǎng)系中的質(zhì)膜,不同于在體腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上的極化分布,提示BBB可能調(diào)控AQP4的分布【19】.大量研究已經(jīng)證明星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間具有相互調(diào)控作用【20,21,22】,而多數(shù)研究?jī)H針對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響,為證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)系中AQP4的分布,研究者將小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd3平置于取自小鼠或大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)體系中,使兩類(lèi)細(xì)胞直接接觸以混合培養(yǎng).和bEnd3內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)7-14d后,星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)都發(fā)生明顯改變.星形膠質(zhì)細(xì)胞由扁平,單1的融合層轉(zhuǎn)變成由延伸的多細(xì)胞柱和肥厚的足突構(gòu)成的島嶼狀,內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu).而bEnd3內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞系培養(yǎng)時(shí)并無(wú)上述改變,證明內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞間的確存在信息交流.免疫熒光分析技術(shù)進(jìn)1步顯示,與星形膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞培養(yǎng)系相比,混合培養(yǎng)體系中AQP4免疫染色增強(qiáng),且極化分布于靠近內(nèi)皮細(xì)胞,GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突,極少或沒(méi)有表達(dá)于質(zhì)膜或細(xì)胞內(nèi)【23】