棉花金屬硫蛋白基因GhMT3a的功能分析及擬南芥與水稻蛋白質(zhì)

1、棉花金屬硫蛋白基因GhMT3a的功能分析及擬南芥與水稻蛋白質(zhì)磷酸酶PP2C基因家族分析    非生物脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素,而其中又以干旱、低溫和鹽漬的影響最為嚴(yán)重。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套主動(dòng)的防御機(jī)制,能夠識(shí)別逆境信息并通過(guò)信號(hào)傳遞最終調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育,從而抵御不良環(huán)境的影響。植物在逆境下通常伴隨大量活性氧(ROS)的產(chǎn)生。一方面活性氧自由基作為信號(hào)分子有效地傳遞逆境信號(hào),另一方面活性氧自由基水平的升高又會(huì)對(duì)植物造成傷害。目前,關(guān)于活性氧自由基介導(dǎo)的基因調(diào)控的研究很少,活性氧自由基在植物脅迫中的功能有待于進(jìn)一步的探索。金

2、屬硫蛋白(Metallothionein,MT)是一類低分子量(60009000Da)、高Cys含量、具有金屬結(jié)合能力的多肽,它具有獨(dú)特的氨基酸排列順序,即多肽的N端和C端具有兩個(gè)富含Cys的金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中的Cys按CX_nC的方式排列。研究表明在動(dòng)物和真菌中MT在很多生理過(guò)程中發(fā)揮作用,包括細(xì)胞內(nèi)激素平衡、氧化脅迫、離子傷害。近來(lái),不斷有研究證明植物MT也具有相似的功能。棉花是一種古老的纖維用經(jīng)濟(jì)作物,它具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和研究?jī)r(jià)值。本文以耐鹽棉花品種中棉19(ZM19)為試驗(yàn)材料,通過(guò)反向northern差異篩選法從鹽誘導(dǎo)棉花幼苗葉片cDNA文庫(kù)中分離得到了一個(gè)與脅迫相關(guān)的克隆,通過(guò)

3、序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因編碼一種金屬硫蛋白,命名為GhMT3a。并對(duì)該基因的功能和分子機(jī)制進(jìn)行了探索。蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酯酶中的一大類,廣泛參與逆境信號(hào)的傳遞過(guò)程。迄今為止,對(duì)植物PP2C蛋白的研究只是局限于個(gè)別基因的鑒定與功能分析,沒有研究從基因組水平對(duì)此基因家族進(jìn)行分析。擬南芥和水稻的基因組測(cè)序的完成為全面的分析和對(duì)比雙子葉和單子葉植物基因家族提供了條件。本研究中以已知PP2C基因的序列作為檢索條件,利用BLAST查找其同源序列,檢索了模式植物擬南芥和水稻的基因組,獲得編碼PP2C蛋白的基因。得到的結(jié)果用SMART或者Pfam檢測(cè)序列中的PP2C元件,最后從擬南芥和水稻基因組

4、中分別鑒定到80個(gè)和78個(gè)PP2C基因。在此基礎(chǔ)上,我們做了基因家族的分類、染色體的定位、表達(dá)模式分析以及基因上游調(diào)控序列等方面的研究。主要結(jié)果如下:1.通過(guò)反向northern差異篩選鹽脅迫誘導(dǎo)棉花幼苗葉片cDNA文庫(kù)獲得的一個(gè)編碼63個(gè)氨基酸的基因。該基因編碼蛋白與植物中金屬硫蛋白具有很高的同源性,具有典型的植物3類金屬硫蛋白序列特點(diǎn),命名GhMT3a。2.Northern blot表達(dá)分析表明GhMT3a能被NaCl、低溫、干旱、CuSO_4、ZnSO_4、百草枯(PQ)、過(guò)氧化氫(H_2O_2)、ABA和乙烯等多種脅迫及激素信號(hào)誘導(dǎo)表達(dá),而抗氧化劑N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acet

5、yl-L-cysteine,NAC)能夠有效的抑制NaCl、低溫、干旱脅迫對(duì)GhMT3a誘導(dǎo)。對(duì)過(guò)氧化氫相對(duì)水平的測(cè)定結(jié)果表明NAC能夠有效地降低NaCl、低溫、干旱脅迫條件下棉花幼苗中ROS水平。這些結(jié)果說(shuō)明GhMT3a具有金屬硫蛋白受重金屬誘導(dǎo)的功能,ROS是非生物脅迫誘導(dǎo)GhMT3a表達(dá)的重要信號(hào)物質(zhì)。3.同野生型相比,過(guò)量表達(dá)GhMT3a的轉(zhuǎn)基因煙草能在200、300 mM NaCl,4,25%PEG條件下更好的生長(zhǎng)。而脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草中的H_2O_2水平遠(yuǎn)低于野生型煙草。過(guò)量表達(dá)GhMT3a能夠有效的提高轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)PQ和H_2O_2的抗性。這些結(jié)果說(shuō)明GhMT3a能夠在真核細(xì)

6、胞內(nèi)有效地清除ROS,維持ROS平衡從而提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性。4.對(duì)GhMT3a體外結(jié)合Zn(2+)能力的測(cè)定表明每個(gè)GhMT3a蛋白最多能結(jié)合5個(gè)鋅離子,說(shuō)明GhMT3a具有金屬硫蛋白家族結(jié)合金屬離子的特性。5.利用BLAST同源檢索分別從模式植物擬南芥和水稻中鑒定到80和78個(gè)PP2C基因。neighbor-joining法分別構(gòu)建擬南芥和水稻中PP2C基因家族的系統(tǒng)發(fā)生樹,根據(jù)分支上的解靴帶值將擬南芥與水稻的PP2C家族分別分為13與11個(gè)亞家族,基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)元件分析結(jié)果都支持這一分類。對(duì)擬南芥和水稻中PP2C基因的對(duì)比分析表明擬南芥的PP2C 13個(gè)亞家族在水稻PP2C家族中

7、都能找到同源基因,說(shuō)明植物中PP2C各個(gè)亞家族在單子葉和雙子葉植物分化之前已經(jīng)形成。6.利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)分別將擬南芥和水稻中的PP2C基因在染色體上進(jìn)行了定位。通過(guò)對(duì)復(fù)制區(qū)域的PP2C基因的分析與對(duì)比發(fā)現(xiàn),基因組加倍事件對(duì)單子葉和雙子葉PP2C基因家族的形成都發(fā)揮了重大的作用。但是,基因的串聯(lián)復(fù)制對(duì)水稻中的PP2C基因家族的形成的影響更為明顯。7.利用MEME元件分析工具對(duì)擬南芥和水稻中的PP2C基因家族分析獲得11個(gè)保守的元件序列。大部分元件廣泛分布PP2C基因家族成員中。而個(gè)別元件僅僅存在于少數(shù)幾個(gè)亞家族中。這種差異為研究不同亞家族之間功能的差別提供了線索。8.利用Genevestigato

8、r,MPSS和EST的公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源統(tǒng)計(jì)了擬南芥中PP2C基因的組織表達(dá)模式。根據(jù)表達(dá)模式的差異可以將PP2C基因分為三類,第一類的基因在四種檢測(cè)的組織中都有表達(dá),這類基因在擬南芥中有49個(gè),第二類包括擬南芥中的28個(gè)基因,這些基因只在部分組織中表達(dá);第三類的基因是組織特異表達(dá)的基因,包括3個(gè)擬南芥中的PP2C基因。同樣,根據(jù)表達(dá)模式的差異,水稻中的PP2C基因也可以分為三類,分別包含27、45、6個(gè)PP2C成員。這些結(jié)果說(shuō)明多數(shù)PP2C家族成員在植物發(fā)育的不同階段發(fā)揮功能。9.通過(guò)Genevestigator上的芯片數(shù)據(jù)分析擬南芥PP2C基因家族所有成員在ABA及數(shù)種脅迫信號(hào)條件下的表達(dá)模式

9、。與其他亞家族不同,亞家族A所有成員都能夠被ABA和數(shù)種脅迫信號(hào)誘導(dǎo)表達(dá)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明ABA和脅迫處理?xiàng)l件下水稻亞家族A成員的表達(dá)也受到了明顯的誘導(dǎo)。這些結(jié)果說(shuō)明單子葉和雙子葉植物中PP2C亞家族A的成員在ABA介導(dǎo)的脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。10.利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)以及矩陣頻率對(duì)擬南芥和水稻亞家族A中19個(gè)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000bp調(diào)控序列進(jìn)行了詳細(xì)的分析。結(jié)果表明它們都含有ABA響應(yīng)元件(ABRE),為這些基因在ABA信號(hào)途徑中發(fā)揮功能提供了證據(jù)。其他調(diào)控元件,比如茉莉酸酮酯響應(yīng)元件(TGACG motif),在水稻和擬南芥中的分布存在顯著差異,暗示單子葉和雙子葉植物PP2

10、C基因家族存在不同的調(diào)控模式。同主題文章1.    章波,向渝梅,白云,許雪青,王燕. 小鼠peroxiredoxin基因家族的生物信息學(xué)分析' J. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2005.(09)    2.    王少峽,陳麗媛,張競(jìng)秋,王振英. 利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物' J. 天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2006.(02)    3.    李榮昌,向青,王夔. 螯合劑

11、從型金屬硫蛋白中競(jìng)爭(zhēng)鎘的研究' J. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 1990.(06)    4.    茹炳根,潘愛華,黃秉乾,張建業(yè). 金屬硫蛋白' J. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 1991.(04)    5.    李令媛,馬宏寶. 生物化學(xué)的新熱點(diǎn)金屬硫蛋白' J. 世界農(nóng)業(yè). 1993.(08)    6.    黃仲賢，鄭起

12、，顧偉強(qiáng)，王韻華. 銀誘導(dǎo)大鼠肝臟金屬硫蛋白的提純與鑒定' J. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào). 1996.(09)    7.    生物信息學(xué)' J. 天津科技. 2004.(06)    8.    張桂春. 金屬硫蛋白的功能及應(yīng)用前景' J. 煙臺(tái)師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2005.(02)    9.    程時(shí). 金屬硫蛋白' J. 生理科學(xué)進(jìn)展. 1987.(04)    10.    趙保路. 吸煙、自由基和癌