甲醛誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)蛋白質(zhì)研究(1)

1、    甲醛誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)蛋白質(zhì)研究(1)    目的 研究甲醛誘導(dǎo)真核細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)及其可能的機(jī)制。方法 建立甲醛刺激人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)適應(yīng)性反應(yīng)模型；采用AlamarBlue還原率檢測(cè)細(xì)胞增殖。雙向凝膠電泳分離細(xì)胞總蛋白，圖像分析后選取差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果 AlamarBlue檢測(cè)結(jié)果表明，低劑量甲醛預(yù)刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)。雙向凝膠電泳結(jié)果顯示，甲醛刺激后19個(gè)蛋白斑點(diǎn)發(fā)生變化，肽指紋圖譜及肽序列標(biāo)簽鑒定了其中13個(gè)蛋白斑點(diǎn)，已鑒定的蛋白包括二磷酸核苷酸激酶、延長(zhǎng)因子1-，

2、磷酸丙糖異構(gòu)酶、60S酸性核糖體蛋白P0、75kDa熱休克蛋白、70kD熱休克蛋白樣結(jié)合蛋白、鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白I、假想蛋白FLJ34423、微管-肌動(dòng)蛋白交叉連接因子1、核纖層蛋白B2、ATP合成酶鏈、蛋白酶體亞基6，這些蛋白功能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白折疊、信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、細(xì)胞骨架等各個(gè)方面。結(jié)論 低劑量甲醛可誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，多種蛋白參與細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)調(diào)控。關(guān)鍵詞： 甲醛；適應(yīng)性反應(yīng)；蛋白質(zhì)組Proteomie analysis of adaptive response induced by low concentration of formaldehyde in human

3、 embryonic fibroblasts cells Abstract： Objective To study the adaptive response induced by formaldehyde(FA) on eukaryocyte and its possible mechanism.Methods After FA treatment，AlamarBlue reducing rate was observed to determine the cell proliferation.The total cellular proteins were separated using

4、two-dimensional gel electrophoresis and visualized by sliver staining.Gels from different batches of control and FA-treated MRC-5 cells were analyzed for quantitative spot comparisons with the ImageMaster 2D platinum 5.0 software.The differentially expressed prorein spots were picked and digested in

5、 gel then identified by tandem mass spectrum.Results The results of AlamarBlue reducing rate showed that low concentration of FA induced adaptive response on MRC-5 cells.Nineteen spots were changed significantly after FA treatment.Thirteen proteins were identified by peptide mass fingerprinting 

6、;or peptide sequence analysis，including putative nucleoside diphosphate kinase，elongation factor 1-gamma，triosephosphate isomerase，60S acidic ribosomal protein P0，heat shock protein 75 kDa,similar to heat shock 70kD protein binding protein，annexin I，hypothetical protein FLJ34423，microtubule-act

7、in crosslinking factor 1，lamin B2，ATP synthase alpha chain，mitochondrial precursor，proteasome subunit alpha type 6.These identified proteins involved in energy metabolism，translation and RNA processing,protein folding，redox regulation,cell structure and cell signaling.Conclusion Adaptive response ca

8、n be induced by low concentration of FA on MRC-5 cells and cellular adaptation is a complex process involving in a modulation of diverse cellular functions.Key words： formaldehyde；adaptive response；proteomics    適應(yīng)性反應(yīng)（adaptive response）是機(jī)體受到低劑量環(huán)境因子預(yù)刺激后對(duì)后續(xù)高劑量的刺激產(chǎn)生耐受的現(xiàn)象。研究表明1，許多環(huán)境刺

9、激因子低劑量接觸可誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)。但適應(yīng)性反應(yīng)是否為自然界普遍存在的現(xiàn)象，適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制還未闡明。甲醛(FA)是常見的環(huán)境化學(xué)污染物，早期研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體接觸低劑量甲醛可能誘導(dǎo)產(chǎn)生某種耐受與適應(yīng)現(xiàn)象，但尚未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討2，3。本實(shí)驗(yàn)利用建立的甲醛適應(yīng)性反應(yīng)細(xì)胞模型，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了甲醛刺激后人胚肺成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)差異，并用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定差異蛋白，為了解甲醛誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的分子機(jī)制提供依據(jù)。1 材料與方法11 材料 甲醛(上海標(biāo)準(zhǔn)試劑）、硫脲(美國(guó)Sigma公司)；等電聚焦膠條(13cm pH47)、尿素、二巰基蘇糖醇(瑞典Amersham公司)；丙基磺酸鹽、碘乙酰氨(美國(guó)US

10、P公司)；胰蛋白酶(測(cè)序級(jí))、丙烯酰胺(美國(guó)Promega公司)；AlamarBlue染料(美國(guó)Biosource公司)；其余試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純。12 方法121 細(xì)胞培養(yǎng) MRC-5細(xì)胞來(lái)源于成都腫瘤研究所，培養(yǎng)于改良的伊格培養(yǎng)基(DMEM)，含10胎牛血清，100kU/L青霉素，100mg/L鏈霉素。FA臨用前用無(wú)血清DMEM配制。122 AlamarBlue檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔板，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按實(shí)驗(yàn)方案分別加入適應(yīng)性反應(yīng)劑量(10mol/L)及攻擊劑量(500mol/L)的甲醛，對(duì)照組分別加入相同體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入10l染料，繼續(xù)培養(yǎng)4h用酶

11、標(biāo)儀測(cè)吸光度值計(jì)算AlamarBlue還原率。123 雙向凝膠電泳 參照Amersham公司技術(shù)手冊(cè)及本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的技術(shù)方法4，上樣量90g，上樣體積250l，等電聚焦4200048000vhs，聚焦時(shí)間1921h。樣品收集方案：FA染毒低劑量組為10mol/L刺激12h，高劑量組為500mol/L FA刺激5h，適應(yīng)組為10mol/L FA預(yù)刺激12h后500mol/L FA刺激5h，空白對(duì)照組加入相應(yīng)體積無(wú)血清DMEM，收集不同批次的細(xì)胞重復(fù)至少3次。124 圖像采集和分析 染色后的雙向電泳凝膠用的圖像掃描儀掃描(瑞典Amersham公司)后采用ImageMaster 2D platinu

12、m 5.0軟件進(jìn)行圖像分析。分析過(guò)程包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)及編輯、背景扣除、以全體點(diǎn)之和作歸一化處理后進(jìn)行斑點(diǎn)匹配。分析3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得二維電泳膠，結(jié)果以占總蛋白點(diǎn)灰度值的百分比表示。最大比值(Max ratio)為各組數(shù)值間最大值與最小值的比，如各組間有為0的數(shù)據(jù)，Max ratio計(jì)為100000。    125 質(zhì)譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索 切取在不同批次膠上重復(fù)性較好的差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，膠內(nèi)酶解后用質(zhì)譜分析(ABI4700,美國(guó)ABI公司)檢測(cè)，激光強(qiáng)度355nm, 200Hz,選定5個(gè)最強(qiáng)峰做串聯(lián)質(zhì)譜，所得肽譜用搜索引擎(MASCOT)對(duì)人類蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)(

13、IPI HUMAN)搜索。            作者：李習(xí)藝，莊志雄，劉建軍，楊曉華，衛(wèi)秦芝，黃海燕【關(guān)鍵詞】甲醛；適應(yīng)性反應(yīng)；蛋白質(zhì)組摘 目的研究甲醛誘導(dǎo)         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。13 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS110軟件

14、進(jìn)行單因素方差分析；二維電泳圖像分析采用ImageMaster 2D Platinum5.0軟件分析。2 結(jié)果21 低劑量FA預(yù)刺激對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的影響 MRC-5細(xì)胞分別給予500mol/L FA刺激5h，及10mol/L FA預(yù)刺激12h后500mol/L FA刺激5h，檢測(cè)AlamarBlue還原率。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組AlamarBlue還原率為(0.5771±0.0238)，高劑量組下降至(0.4922±0.019)，適應(yīng)組細(xì)胞為(0.56911±0.03383)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。22 低劑量FA預(yù)刺激后MRC-5細(xì)胞雙向電泳圖譜差異 經(jīng)圖像分析

15、發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MRC-5細(xì)胞檢測(cè)到(834±74)個(gè)蛋白點(diǎn)，低劑量組為(917±118)個(gè)，高劑量組為(820±116)個(gè)，適應(yīng)組為(874±107)個(gè)，凝膠匹配后發(fā)現(xiàn)，19個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)發(fā)生改變，變化量達(dá)2倍以上，見表1。表1 FA刺激后二維電泳差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)（略）23 低劑量FA預(yù)刺激后MRC-5細(xì)胞差異蛋白質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索 選擇19個(gè)差異表達(dá) 的蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，經(jīng)肽指紋圖譜(PMF)及肽序列標(biāo)簽(MSMS)鑒定了其中13個(gè)蛋白點(diǎn)，其余因無(wú)法得到好的肽指紋圖譜或搜索數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)無(wú)法得到可信度較高的結(jié)果而未能鑒定。已鑒定的蛋白結(jié)果見表2。3 討論本研究結(jié)

16、果顯示，低劑量FA預(yù)刺激后細(xì)胞可耐受更大劑量FA的攻擊，提示FA可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。磷酸丙糖異構(gòu)酶參與多種能量代謝途徑；二磷酸核苷酸激酶與三磷酸核苷合成有關(guān)，是癌基因c-Mye的激活因子；蛋白酶體參與泛素依賴的蛋白降解；60S酸性核糖體蛋白PO與E.Coli蛋白L10功能相似；75kDa熱休克蛋白及70kDa熱休克蛋白樣結(jié)合蛋白作為分子伴侶或分子伴侶結(jié)合蛋白發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)；微管-肌動(dòng)蛋白交叉連接因子1、核纖層蛋白B2與細(xì)胞骨架相關(guān)；鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白I(ANX I)為鈣依賴的磷脂結(jié)合家族成員，具有多種生物學(xué)功能；延長(zhǎng)因子1在蛋白翻譯過(guò)程中起重作用：ATP合成酶鏈與ATP合成有關(guān)，提示甲

17、醛誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需多種蛋白共同參與。本研究所鑒定的甲醛適應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)蛋白中，熱休克蛋白和ANX I的誘導(dǎo)表達(dá)與氫醌誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果有共同之處4。提示這2種蛋白可能在化學(xué)物誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)的共同機(jī)制中具有重作用。已有研究表明，在應(yīng)激條件下熱休克蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用5。ANX I也可被熱應(yīng)激、過(guò)氧化氫、亞砷酸鹽等多種因素誘導(dǎo)，提示ANX I也可能是一種熱休克蛋白(HSPs)6。HSPs在化學(xué)物誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)中所起的作用是特異性的抑制或非特異性，其表達(dá)是適應(yīng)性反應(yīng)產(chǎn)生的因或果，以及HSPs與其他適應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)蛋白之間的關(guān)系都有待進(jìn)一步研究。表2 F

18、A調(diào)節(jié)蛋白Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果（略）注：a PMF鑒定結(jié)果；b MS/MS鑒定結(jié)果參考文獻(xiàn)1 劉樹錚.低水平環(huán)境因子與適應(yīng)性反應(yīng)J.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1998，18(5)：310-315.2 Zwart A，Woutersen RA，Wilmer JW,et al.Cytotoxic and adaptive effects in rat nasal epithelium after 3-day and 13-week exposure to low concentrations of formaldehyde vapourJ.Toxicology，1988，51(1)：87-99.3 Nunoshiba T，Hashimoto M，Nishioka H.Cross-adaptive response in Escherichia