益腎通肺湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織MMP9和TIMP1表達(dá)的影響

1、益腎通肺湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織MMP-9MMP-9和TIMP-1TIMP-1表達(dá)的影【摘要】目的觀察益腎通肺湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及其組織抑制因 子-1(TIMP-1)表達(dá)的影響，以探討其防治COPD的機(jī)理。方法 雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為3組：空白組、模型組和治療組。模型組 大鼠兩次予益腎通肺湯。30 d后行支氣管肺泡灌洗，計(jì)數(shù)灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)及 分 類，免疫組化方法觀察肺組織MMP 9和TIMP-1的表達(dá)情況。肺組 織切片行蘇木素伊紅(HE)染色，觀察形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果MMP 9和TIMP-1的表達(dá)與空白組相

2、比明顯增強(qiáng)(P0.01)o治療組與 模型 組相比,MMP-9和TIMP-1的表達(dá)相對(duì)減弱(P0.01)o結(jié)論 益腎通肺湯能 降低COPD大鼠肺組織中MMP 9和TIMP-1的表達(dá)，起到 防治COPD的 作用。(作者:單位:郵編:氣管內(nèi)滴入脂多糖加被動(dòng)吸煙復(fù)制COPD模型。治療組給模型組【關(guān)鍵詞】益腎通肺湯；慢性阻塞性肺疾病；基質(zhì)金屬蛋白酶 9;基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1；脂多糖Abstract : Objective To explore the role of prevention and treatment ofYishentongfei decoction in COPD by me

3、asuring the expression ofMMP-9 and TIMP-1 in lung tissue. Methods 36 male Wistar rats of rat model with chronicobstructive pul monary disease was established by exposure to cigarette smoke dailyfor 30 days and injection of LPS in trachea twice. The rats were randomly separatedinto three groups, the

4、normal group, the model group and the treatment group. Totalcell counts and neutrophil counts in BALF were examined. The expression of MMP 9 and TIMP 1 in lung tissue was measured by means of im mun ohistochemistry (SP).Lung tissue section stained by HE was observed to study the morp hological alter

5、nations. Result The exp ression of MMP 9 and TIMP-1 in lung tissue of the modelrats sig nifica ntly in creasedcom pared with the no rmal rats (P0.01), and decreased relatively com pared withthe treatme nt rats (PO ,01),Yishe nton gfei decocti on can reduce the expressi on of MMP-9 andTIMP 1 in lung

6、tissue of rat model of COPD, and has effect o n the preve nti onand treatme nt of COPD.Key words : Yishentongfei Decotion ; COPD ； MMP-9 ； TIMP-Con clusi onLPS基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組由鋅、鈣離子依賴性，結(jié)構(gòu)相似的基質(zhì)降解蛋白酶組成的蛋白酶家族，近年研究表明,MMP參與肺組疾病(COPD)形成、發(fā)展、炎癥持續(xù)方面起了重要作用。我們采用氣 管內(nèi) 注入脂多糖(LPS)和反復(fù)煙熏的方法制作COPD大鼠模型， 采用免疫組化 法檢

7、測(cè)MMP-9及其組織抑制因子-1(TIMP-1)在COPD大鼠 支氣管肺組織 中的表達(dá)，以探討二者在COPD發(fā)病中的作用。1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物健康成年雄性Wistar大鼠36只(購(gòu)自蘭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14-006號(hào))，體重(250 i20)g,鼠齡10周。1 2藥物益腎通肺水煎液(由人參、蛤蛤、蘇木、尊苗子、水蛭、紫苑組成),200%濃度,甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥制劑室提供。1 3儀器及試劑德國(guó)LEICARM 2135型石蠟切片 機(jī),石蠟包埋機(jī)；德國(guó)LEICARM 1020型脫水機(jī)；動(dòng)物熏吸箱，甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科自制；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。2實(shí)驗(yàn)方法2

8、.1分組大鼠隨機(jī)分為3組。對(duì)照組（A組,12只）：正常飼養(yǎng),灌服等織細(xì)胞外基質(zhì)破壞、重塑以及炎細(xì)胞趨化,在慢性阻塞性肺量生理鹽水。益腎通肺湯治療組（C組,12只）：在制備COPD模型的同 時(shí)，于每天熏香煙前按24 g/ （kg?d）灌服1 g/mL的益腎通肺湯煎液。模型組（B組,12只）:分別于第1、14天氣管內(nèi)注入LPS （200血/200山）；第230天（第14天除外）蘭州牌過(guò)濾嘴香煙（焦油煙量15 mg,煙氣煙堿量1.0 mg）煙霧；每日上下午分別將大鼠置于72 L的密閉玻 璃 箱內(nèi)，將香煙插在50 mL注射針頭上，點(diǎn)燃經(jīng)玻璃箱頂蓋的通氣孔伸 入玻 璃箱，先緩慢抽吸煙霧于空針內(nèi)，再將煙霧

9、推入玻璃箱內(nèi)，如此反復(fù)， 使玻璃箱內(nèi)煙霧濃度達(dá)5%左右,30 min后將大鼠移出玻璃箱，每日熏2次。30 d后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。2.2動(dòng)物處理先將動(dòng)物稱重，腹腔內(nèi)注入2%戊巴比妥鈉（25mg/kg）麻醉，將大鼠仰臥位固定，沿正中線剪開(kāi)皮膚和腹壁肌肉，剪斷兩側(cè)肋骨和胸肌， 暴露胸腔，從喉頭以上剪斷氣管，將胸腔臟器摘除，一并取出心臟，分 離出肺臟。用生理鹽水10 mL分3次行左肺支氣管肺泡灌洗，總回收率為50%80%,灌洗液（BALF）行白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類；于右下肺矢狀面 最大周徑處橫貫取材，10%中性甲醛固定,24 h內(nèi)石蠟包埋、切片。2.3 MMP-9和TIMP-1的檢測(cè)采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧

10、化酶法（武漢博士德公 司,SP即用型試劑盒） 在石蠟切片上測(cè)MMP-9和TIMP-1的免疫組化 表達(dá)， 一抗 為1 100MMP 9和TIMP-1多克隆抗體，二抗為生物素山羊抗兔IgG,陰性對(duì)照標(biāo)本除以PBS代替一抗外，其它步驟與被測(cè)標(biāo)本相同，陽(yáng)性反應(yīng)為 胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。2 4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料采用X s表示，組間 米 用T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行X 2檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類（見(jiàn)表1）表13組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類比較（略）3 2支氣管肺組織MMP-9、TIMP免疫組化結(jié)果（見(jiàn)表2）表2M MP-9、TIMP-1免疫組化表達(dá)分析（略）

11、注：與A組比較,#P0 01;與B組比較，仲0.01;免疫組化表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程空白 組、模型組各死亡大鼠1只。3.3慢性阻塞性肺疾病模型組病理學(xué)改變模型組支氣管肺組織病理表現(xiàn)基本符合人類慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫的特點(diǎn)。光鏡下見(jiàn)支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞部分脫落， 杯狀 細(xì)胞增生，支氣管黏膜下肌層增生、肥厚，黏膜層、黏膜下層及肌層大 量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)支氣管壁周圍可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁變 薄、脹大、破裂或形成大泡，彈力網(wǎng)破壞。4討論鍵。本實(shí)驗(yàn)采用兩次氣管內(nèi)注入適量LPS和反復(fù)煙熏的方法制作吸入有害物質(zhì)引起肺與氣道的持續(xù)炎癥病變是引起COPD的關(guān)COPD大鼠模型。結(jié)果表明，模型組支氣管肺組織病

12、理形態(tài)學(xué)基本符合人類慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫的特點(diǎn)。而且,模型組MMP-9和COPD氣道重塑的研究。MMP是降解氣道各種細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，MMP-9（明膠酶B）主 要降解彈力纖維及明膠W、V型膠原。本研究顯示，模型組大鼠支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、支氣管肺組織微小血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)顯著增強(qiáng)。提示MMP增多可破壞肺泡基質(zhì)成分使肺泡腔擴(kuò)大，肺泡 彈性回縮能力減弱，從而導(dǎo)致氣體滯流1 O另一方面，通過(guò)介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集和破壞上皮/內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，參與炎癥反應(yīng)和組織重建，炎癥細(xì) 胞在 氣道腔及氣道壁中聚集，加重了局部的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣流阻塞。因 此，減輕氣道重塑是進(jìn)行有效防治的先決條件。TIM

13、P是MMP的內(nèi)源性抑制劑，由成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞 和血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生。TIMP-1能特異性地與MMP-9結(jié)合并抑 制其活 性。TIMP還具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣作用，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生 及膠原合 成，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解。因此,TIMP-1是氣道纖維化的標(biāo) 志，反映了氣道修復(fù)及重塑過(guò)程2-3 O本實(shí)驗(yàn)COPD模型組TIMP-1的表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組，其表達(dá)部位與MMP-9相似，這可能與 其抑制MMP的功能有關(guān)。因此,TIMP-1是氣道重塑的重要因子，與MMP 9一起模型組支氣管肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)均顯著增加，表明細(xì)胞外 基TIMP-1的表達(dá)與空白組相比明顯增強(qiáng)（P

14、0.01）,說(shuō)明此法可用于參與支氣管、肺泡壁的損傷及修復(fù)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)COPD質(zhì)的降解及合成代謝均異?；钴S，TIMP-1在抑制MMP-9活性的同 時(shí)， 也引起膠原過(guò)度沉積。益腎通肺湯以腎主納氣為立法依據(jù)，以補(bǔ)腎納氣平喘，益氣活血祛痰為治則。方中人參、蛤蛤相配補(bǔ)益肺腎、納氣定喘以治本；蘇木 與人參相配益氣活血；萼苗子瀉肺祛痰；水蛭活血化瘀；紫苑止 咳平喘。本研究發(fā)現(xiàn)， 應(yīng)用益腎通肺湯后治療組大鼠MMPV和TIMP-1的表達(dá)均明 顯下降，且細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示炎性細(xì)胞數(shù)顯著降低。提示通過(guò)對(duì)MMP-9和TIMP-1的抑制，從而使肺臟基質(zhì)的降解減少和炎癥細(xì)胞 的聚集趨化減輕， 可能是益腎通肺湯干預(yù)COPD形成的機(jī)制之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1曾瓊炎癥細(xì)胞、基質(zhì)金屬蛋白酶與肺氣腫J國(guó)外醫(yī)學(xué)？呼吸系統(tǒng)