足葉乙甙誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中電化學(xué)行為的研究

1、    足葉乙甙誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中電化學(xué)行為的研究        【摘要】目的研究藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡中的電化學(xué)變化及其意義。方法使用電化學(xué)傳感器檢測(cè)經(jīng)足葉乙甙（Vp16）誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡。結(jié)果2200g/ml Vp16作用于HL-60細(xì)胞24小時(shí)的過程中，隨著藥物劑量的增大，細(xì)胞峰值電流逐漸降低，Vp16 2g/ml時(shí)即可觀察到細(xì)胞電化學(xué)活性較對(duì)照組下降，20g/ml時(shí)明顯下降。以Vp16 200g/ml誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過DNA含量分析顯示在2，3，4小

2、時(shí)細(xì)胞凋亡率為10.5%20.0%，用電化學(xué)傳感器方法檢測(cè)細(xì)胞電化學(xué)活性改變差異明顯，峰值電流從1.8A降至0.4A，4小時(shí)時(shí)峰值電流降至用藥前的1/5。結(jié)論在細(xì)胞凋亡早期啟動(dòng)階段的電化學(xué)信號(hào)改變具有一定的早期意義和蓄積性?！娟P(guān)鍵詞】電化學(xué)生物傳感器細(xì)胞系，HL-60依托泊甙 細(xì)胞死亡，程序性 Study on electrochemical behavior of HL-60 cells during the etoposide-inducing apoptosisREN Xinping?, WANG Debing, LI Huaina, et al.Institute of Hematol

3、ogy, Beijing Medical University，Beijing100044【Abstract】ObjectiveTo study the electrochemical behavior of apoptotic HL-60 cells induced with etoposide. MethodsElectrochemical cytosensor was used to monitor HL-60 cells treated with etoposide. ResultsThe peak current and electron transfer rate decrease

4、d as etoposide dosage increased. The decrease appeared at 2g/ml etoposide treatment and was remarkable at 20g/ml, which occurred before the typical changes of cell morphology and DNA contents for apoptosis. FCM-DNA analysis showed that the apoptotic cells were of 10.5%20% while the peak current decr

5、eased from 1.8A to 0.4A after 2,3 and 4 hours treatment with 200g/ml etoposide, and the peak current after 4 hours treatment was 5 times lower than that before induction. Conclusion The changes of electrochemical behavior during the early stage of apoptosis occurred earlier and could be accumulated.

6、【Key Words】ElectrochemistryBiosensorsCell line, HL-60EtoposideApoptosis細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞動(dòng)物生命活動(dòng)中不可缺少的組成部分，被廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)生和發(fā)育、器官平衡穩(wěn)定、免疫防御和對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究之中。與細(xì)胞壞死不同的是，細(xì)胞凋亡是受到某些生理或病理信號(hào)刺激后受嚴(yán)格控制的事件，具有典型的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)特征，即形態(tài)學(xué)觀察到凋亡小體的出現(xiàn)，DNA電泳有200bp左右的梯形條帶，DNA含量分析顯示亞二倍體凋亡峰1，2。在這些表現(xiàn)出現(xiàn)之前，細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷過一系列生化和生理變化，其機(jī)制尚不完全清楚，因此對(duì)這些變化的研究成為研究細(xì)胞凋亡的重

7、要內(nèi)容3。我們采用電化學(xué)的方法觀察HL-60細(xì)胞在化療藥物足葉乙甙（Vp16，北京制藥廠生產(chǎn)）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中的電化學(xué)行為，表明在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞具有活躍的電化學(xué)活性改變。深入研究這種變化有助于對(duì)細(xì)胞凋亡早期機(jī)制的認(rèn)識(shí)。材料和方法1細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37條件下，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為5×105/ml。加藥組：分別以2，4，10，20，40，80，100，150，200，300g/ml Vp16作用24小時(shí)，以40，200，500g/ml Vp16作用14小時(shí)，對(duì)照組不加藥物。2活細(xì)

8、胞計(jì)數(shù)取上述細(xì)胞懸液， 加入等體積的臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻后計(jì)數(shù)，拒染細(xì)胞為活細(xì)胞（包括凋亡細(xì)胞），染為藍(lán)色的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。3細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)取細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS）洗2遍后，細(xì)胞懸液經(jīng)離心涂片機(jī)涂片，瑞氏染色后光鏡觀察。4DNA含量分析及DNA電泳1×106細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定過夜，離心棄上清，加入50l檸檬酸-PBS，室溫30分鐘，離心，取上清（含有小分子量DNA）進(jìn)行DNA電泳，繼續(xù)加入3l 體積分?jǐn)?shù)為0.25%的NP40，3l RNaseA，37水浴30分鐘，3l蛋白酶K（1mg/ml）37水浴30分鐘，無水乙醇及3mol/L乙酸銨沉淀2小時(shí)，離心后加上樣緩沖液，

9、50V電泳2小時(shí)，紫外燈下觀察。沉淀細(xì)胞復(fù)懸于0.5ml PBS中，進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析，加入終濃度50g/ml RNaseA 30分鐘后，加入終濃度50g/ml碘化丙錠（PI）避光染色30分鐘后上機(jī)檢測(cè)，與對(duì)照組相比，低于G0/G1期細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，其占細(xì)胞總數(shù)的比例為凋亡細(xì)胞比例。5細(xì)胞電化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)使用北京大學(xué)化學(xué)研究所負(fù)壓型電子伏安細(xì)胞傳感器完成。該電極感受系統(tǒng)由三個(gè)電極組成，細(xì)胞室頂端是石墨工作電極，底面是硝酸纖維濾膜與緩沖室相連，緩沖室內(nèi)為輔助鉑電極和參比甘汞電極，使用PAR174極譜分析儀和3033XY記錄儀。測(cè)試時(shí)先將工作電極清洗后放入細(xì)胞室，循環(huán)掃描至穩(wěn)定狀態(tài)，用0.1mo

10、l/L PBS洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量達(dá)2.5×105后注入細(xì)胞室，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié) 果1HL-60細(xì)胞的電子伏安掃描經(jīng)洗滌后的HL-60細(xì)胞懸液以及用于清洗細(xì)胞的PBS掃描時(shí)顯示：掃描速率為50mV/s，HL-60細(xì)胞于0.715V出現(xiàn)陽極峰，緩沖液沒有波形出現(xiàn)，說明波形不是由于細(xì)胞釋放的化學(xué)物質(zhì)造成。2HL-60細(xì)胞凋亡過程的電化學(xué)行為40，200g/ml Vp16作用于HL-60細(xì)胞，分別在1，2，3，4小時(shí)收集細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后注入細(xì)胞敏感池中檢測(cè)。結(jié)果顯示，在所觀察范圍內(nèi)，隨著藥物劑量增大及用藥時(shí)間延長(zhǎng)，試驗(yàn)組峰值電流逐漸降低(1)。分別以2200g/ml Vp16

11、處理HL-60細(xì)胞24小時(shí)，隨著藥物劑量的增大，DNA電泳及流式細(xì)胞術(shù)DNA含量分析可觀察到逐漸出現(xiàn)的典型DNA梯形條帶和亞二倍體凋亡峰（2，3），表明Vp16能有效地誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，同時(shí)使用電化學(xué)傳感器方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞峰值電流逐漸降低（4），表明藥物與細(xì)胞接觸后可影響細(xì)胞的電化學(xué)行為，此電化學(xué)行為的變化與藥物作用于細(xì)胞的濃度和作用時(shí)間有關(guān)。    42200g/ml Vp16處理HL-60細(xì)胞24小時(shí)的峰值電流3HL-60細(xì)胞凋亡早期的電化學(xué)行為觀察Vp16 2g/ml作用于HL-60細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞電化學(xué)活性較對(duì)照組已有下降；200g/ml

12、 Vp16作用1小時(shí)時(shí)已有較明顯的峰值電流改變（而此時(shí)DNA電泳、DNA含量分析均無凋亡指標(biāo)）；隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，3小時(shí)時(shí)峰值電流已降至基礎(chǔ)值的75%，而此時(shí)DNA含量分析僅有16%細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，提示在細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期階段（該階段從形態(tài)學(xué)上無法觀察到）細(xì)胞的電化學(xué)行為已經(jīng)發(fā)生了變化。4HL-60細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的電化學(xué)行為比較以40，200，500g/ml Vp16作用于HL-60細(xì)胞4小時(shí)，形態(tài)學(xué)觀察、壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)以及DNA含量分析顯示細(xì)胞分別處于存活（活細(xì)胞95%）、凋亡（凋亡細(xì)胞18%，壞死細(xì)胞15%）以及壞死（95%細(xì)胞為死細(xì)胞）狀態(tài)，細(xì)胞所表現(xiàn)的電子伏安行為是隨Vp16劑量增大

13、，峰值電流逐漸降低，分別較對(duì)照組下降70%、80%、95%，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的過程中，兩者的電化學(xué)反應(yīng)一致，說明電化學(xué)反應(yīng)在凋亡早期過程中即可表現(xiàn)出來，但在凋亡晚期和壞死的發(fā)展過程中此種反應(yīng)缺乏特異性。討論細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞死亡的形式之一，有其典型的形態(tài)學(xué)和生化特征，對(duì)凋亡細(xì)胞的確定有賴于這些特征的出現(xiàn)，然而在細(xì)胞形態(tài)學(xué)和DNA改變之前，凋亡細(xì)胞早已經(jīng)進(jìn)行了包括細(xì)胞內(nèi)離子如Ca離子、酶-輔酶系統(tǒng)活性(如蛋白激酶)等一系列生化反應(yīng)及生理過程的改變4。多種因素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制尚不清楚。由于細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)大都具有電化學(xué)性質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)所造成的電化學(xué)變化可以通過電極表現(xiàn)出來，氧化

14、還原狀態(tài)不同時(shí)，細(xì)胞電子傳遞速率不同，反映出被動(dòng)電化學(xué)行為不同5，6。電化學(xué)傳感器是利用先進(jìn)的電子學(xué)和光學(xué)技術(shù)可以記錄細(xì)胞的生物化學(xué)和生物物理反應(yīng)的過程，已證實(shí)應(yīng)用這種電化學(xué)傳感器檢測(cè)細(xì)胞的電化學(xué)行為具有一定的可識(shí)別性和不可逆性。我們采用Vp16處理HL-60細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡早期階段，細(xì)胞逐漸發(fā)生電化學(xué)活性的變化，隨著藥物劑量增加及用藥時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的峰值電流下降，以后繼續(xù)下降并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的其它特征性改變。Vp16極小劑量(2g/ml)時(shí)即可反映出峰值電流改變，20g/ml時(shí)明顯下降，說明應(yīng)用此方法分析細(xì)胞凋亡較常規(guī)的形態(tài)學(xué)和生化等方法更敏感；以200g/ml Vp16誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

15、，通過DNA含量分析顯示，2，3，4小時(shí)時(shí)凋亡細(xì)胞在10.5%20.0%，但細(xì)胞電化學(xué)活性改變差異明顯，峰值電流從1.8A降至0.4A，4小時(shí)時(shí)峰值電流降至用藥前的1/5，提示在細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)和DNA鏈改變之前，細(xì)胞可能經(jīng)歷了一個(gè)電化學(xué)改變的累積過程。我們的研究結(jié)果顯示細(xì)胞的電化學(xué)行為可以反映細(xì)胞的生理代謝活性，細(xì)胞處于不同的活性狀態(tài)時(shí)，其電化學(xué)活性亦有差異。使用Vp16誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的電化學(xué)變化反映了藥物可能影響了細(xì)胞電化學(xué)信號(hào)的傳輸及氧化還原系統(tǒng)的活性。盡管此方法對(duì)檢測(cè)細(xì)胞凋亡晚期和壞死過程缺乏特異性，但深入研究凋亡早期階段電化學(xué)行為，進(jìn)一步探討氧化還原系統(tǒng)變化在凋亡啟動(dòng)發(fā)生

16、過程中的作用，將有助于認(rèn)識(shí)細(xì)胞凋亡的早期機(jī)制。作者單位：100044任新萍王德炳（北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院血液病研究所）；李懷娜慈云祥（北京大學(xué)分析化學(xué)研究所）參考文獻(xiàn)1 Morris RG, Duvall ED, Hargreaves AD, et al. Hormone-induced cell death: surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. Am J Pathol, 1984, 115: 426-436.2 Wyllie AH, Kerr JFR, Carrie AR, et al. Cell death: the sig

17、nificance of apoptosis. Intern Rev Cytol, 1980, 68: 251-306.3 Binder C, Hiddemann W. Programmed cell deathmany questions still to be answered. Ann Hematol, 1994, 69: 45-55.4 Allen PD, Bustin SA, Newland AC, et al. The role of apoptosis (programmed cell death) in hemopoiesis and the immune system. Blood Rev, 1993, 7: 63