阿霉素對(duì)人膽管癌細(xì)胞株FRH0201的生物學(xué)特性的影響

1、阿霉素對(duì)人膽管癌細(xì)胞株FRH0201的生物學(xué)特性的影響                        【關(guān)鍵詞】  膽道腫瘤阿霉素腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)液細(xì)胞周期細(xì)胞大小CA125CA19  【摘要】目的：觀(guān)察阿霉素長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201生物學(xué)活性的影響。方法：用2g/ml的阿霉素同一濃度逐漸延長(zhǎng)時(shí)間作用于人膽管癌細(xì)胞株

2、FRH0201細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)作用篩選出能在含1g/ml的阿霉素培養(yǎng)液中生存72h，去掉阿霉素后仍能繼續(xù)穩(wěn)定傳代生長(zhǎng)的細(xì)胞。無(wú)藥培養(yǎng)1月后進(jìn)行生物學(xué)行為的監(jiān)測(cè)。觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)和流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物，激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的阿霉素的熒光強(qiáng)度。結(jié)果：阿霉素作用后FRH0201細(xì)胞形態(tài)學(xué)有輕度改變，細(xì)胞倍增時(shí)間較親本細(xì)胞延長(zhǎng)3h，與親本細(xì)胞相比S期細(xì)胞增多16.89%，G1期細(xì)胞減少29.33%、G2期細(xì)胞增多12.46%。CA125和CA199試驗(yàn)組和親本組分別為9.14和8.60U/ml，1.59和2.96U/ml，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度（熒光強(qiáng)度平

3、均值），親本細(xì)胞為1764.8，試驗(yàn)組細(xì)胞為305.4。結(jié)論：阿霉素對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201的形態(tài)學(xué)及倍增時(shí)間無(wú)明顯影響，但使細(xì)胞進(jìn)入S期、G2期的增多，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度明顯降低，生長(zhǎng)時(shí)間無(wú)明顯變化。    【關(guān)鍵詞】膽道腫瘤阿霉素腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液細(xì)胞周期細(xì)胞大小CA125CA199       The effects of adramycin on the human liver hilar cholangiocarcinona cell line FRH0201   &

4、#160; 【ABSTRACT】Objective:To investigate the effects of adramycin on cell line of FRH0201.Methods:Human hilar cholangiocarcinona cell line were cultured with adramycin (2g/ml) through lasting different times,finally this cell line can survive after 72h cultured in the culture liquid with the adramyc

5、in(1g/ml) .Then the medium was replaced with a fresh one without adramycin,and the cells were continuously cultured for 1 month.The in vitro studies included the observation of the appearance with optical microscope,MTT cell proliferation assay,analysis of the cell cycle by Flow cytometry(FACS),assa

6、ys of tumor marker using enzymelinked immunosor bent assay(ELISA),the fluorescence density of adramycin.Results:Compared to the parent FRH0201cell line:The morphology showed typical morphological characteristics,the doubling time prolonged about 3h,the cell cycle by flow cytometry identified in G1,G

7、2 and S phase of cell cycle were 40.50%,19.74%and 39.77% in trial group,and 69.83%,7.29%and 22.88% in parent group,respectively.Tumor marker has no difference between them,the fluorescence density of epirubicin descending 5.2 times.Conclusion:The adramycin can affect the cell cycle and cause the cha

8、nge of metabolism.    【KEY WORDS】Biliary tract neoplasmsAdramycinTumor cells,culturedCell cycleCell sizeCA125CA199    目前，肝門(mén)部膽管癌手術(shù)切除率已明顯提高，手術(shù)病死率明顯下降，但真正達(dá)到根治性切除的病例很少，局部復(fù)發(fā)率很高，現(xiàn)有的化療及放療未見(jiàn)明顯的效果。其原因可能與肝門(mén)部膽管癌的生物學(xué)特性有關(guān)1。為此，我們觀(guān)察阿霉素長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201生物學(xué)活性的影響。    1&#

9、160; 材料和方法    1.1  材料  阿霉素購(gòu)于深圳萬(wàn)樂(lè)公司，MTT購(gòu)自愛(ài)博生物工程有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。膽管癌細(xì)胞株FRH0201由本課題組吳小鵬教授構(gòu)建2。    1.2  方法  采用濃度相同不斷增加作用時(shí)間的方法確定阿霉素培養(yǎng)液終濃度為1g/ml。首先分別向FRH0201細(xì)胞株的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入不同濃度的阿霉素（Adramycin,ADR），培養(yǎng)3d后觀(guān)察細(xì)胞死亡情況。結(jié)合阿霉素的血漿濃度，選擇可將50%的細(xì)胞抑制的藥物濃度（IC50）作為耐藥細(xì)胞培養(yǎng)的起始濃度（2g

10、/ml），將腫瘤細(xì)胞置于該培養(yǎng)液中和不含藥物的10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，傳代兩次，再將篩選出的細(xì)胞在相同藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)1，2，3，6，12，24，36，48，60，72h 10個(gè)時(shí)間段約8個(gè)月的培養(yǎng)，最終使細(xì)胞能夠在1g/ml阿霉素培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個(gè)月在檢測(cè)細(xì)胞的生物特性。    1.3  觀(guān)察指標(biāo)    1.3.1  形態(tài)學(xué)觀(guān)察  將兩株細(xì)胞分別爬片后經(jīng)HE染色，光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察。  &#

11、160; 1.3.2  細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本細(xì)胞即未用藥的細(xì)胞和阿霉素作用的細(xì)胞與試驗(yàn)組細(xì)胞各一瓶，0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，96孔板中每孔接種2001，37、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每天取3個(gè)復(fù)孔計(jì)數(shù)活細(xì)胞，計(jì)算平均值，連續(xù)觀(guān)察7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，以細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱軸，繪制半對(duì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，于生長(zhǎng)曲線(xiàn)上對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)取3組數(shù)據(jù)，根據(jù)最小二乘法進(jìn)行直線(xiàn)回歸，在直線(xiàn)上任取兩點(diǎn)（Nt、No），根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間(Td）3。T代表NoNt的時(shí)間Td=T×

12、;Ig2/Ig(Nt/No）    1.3.3  細(xì)胞周期分析  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各1×106個(gè)/ml，制成單細(xì)胞懸液，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，于流式細(xì)胞儀（FCM）上行細(xì)胞周期分析。    1.3.4  腫瘤標(biāo)記物CA125、CA199  分別將同等數(shù)量的親本及試驗(yàn)組細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，分別收集培養(yǎng)液各10ml，1000r/min離心5min后取上清，用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行CA125及CA199的檢測(cè)。 

13、                                1.3.5  激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)  將親本細(xì)胞與試驗(yàn)組細(xì)胞制備單層細(xì)胞爬片。將載玻片置于培養(yǎng)皿中10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)均勻布滿(mǎn)載玻片后加入2g

14、/ml阿霉素作用30min，PBS洗滌細(xì)胞2次，在磁共振共聚焦顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強(qiáng)度表示。然后計(jì)算平均值。    2  結(jié)  果    2.1  形態(tài)學(xué)改變  倒置顯微鏡下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FRH0201細(xì)胞呈鋪路石狀鑲嵌緊密排列，細(xì)胞呈多邊形、梭形、圓形、不規(guī)則形、三角形等各種形態(tài)，生長(zhǎng)活躍，細(xì)胞體積變大，折光性差，核漿比例變大，細(xì)胞核增大。有多核細(xì)胞，有異常核分裂相。    2.2  細(xì)胞倍增時(shí)間  實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞倍增時(shí)間為23.6h

15、，延長(zhǎng)了約3h。    2.3  細(xì)胞周期分析  實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與親本細(xì)胞相比：S期細(xì)胞增多16.89%，G1期細(xì)胞減少29.33%、G2期細(xì)胞增多12.46%。見(jiàn)圖1、2。    2.5  激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)  細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強(qiáng)度表示，計(jì)算平均值。見(jiàn)圖3。    3  討  論肝門(mén)膽管癌及膽囊癌術(shù)后化療是重要的輔助治療手段，但化療的敏感性不高。且可能存在個(gè)體性差異及可能誘發(fā)的腫瘤多藥耐藥性。為了臨床及基礎(chǔ)方面對(duì)膽道惡性腫瘤綜合治療的研究

16、，F(xiàn)RH0201細(xì)胞代表原發(fā)灶的所有細(xì)胞群體2，并已成功建立裸鼠動(dòng)物模型3、4，我們用阿霉素對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察對(duì)其生物學(xué)特性的影響。為了更接近臨床膽管癌化療反復(fù)間歇用藥的特點(diǎn)，對(duì)FRH0201細(xì)胞采用大劑量反復(fù)間歇同一濃度不同時(shí)間暴露，歷時(shí)8個(gè)月，獲得了穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞。本次試驗(yàn)不同于其它耐藥株固定藥物濃度，這更符合臨床用藥方式。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在低氧時(shí)，腫瘤細(xì)胞在含有阿霉素的培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，一旦更換培養(yǎng)基后同樣劑量的藥物，細(xì)胞雖然可以繼續(xù)貼壁伸展。但藥物持續(xù)存在時(shí)卻出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸減少。該細(xì)胞生物學(xué)特性的研究將為下一步耐藥株的建立，探討膽管癌耐藥

17、機(jī)理及逆轉(zhuǎn)耐藥奠定基礎(chǔ)。以往研究發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞株比較，耐藥細(xì)胞株在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及代謝水平等方面均發(fā)生了顯著變化5。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在無(wú)藥培養(yǎng)1個(gè)月后生長(zhǎng)穩(wěn)定，倍增時(shí)間稍有延長(zhǎng)，其分泌的腫瘤標(biāo)記物如CA125、CA199較親本細(xì)胞有所降低，這可能與藥物抑制細(xì)胞活性有關(guān)，也可能是藥物導(dǎo)致了細(xì)胞的分化有關(guān)，但是細(xì)胞排泄毒性藥物的作用得到了增強(qiáng)。我們推測(cè)這些生物學(xué)性狀的改變與其耐藥表型密切相關(guān)，但其詳細(xì)機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，藥物處理前后試驗(yàn)組G1期細(xì)胞比親本組約減少29.33%，G2期細(xì)胞比親本組增加12.46%，S期細(xì)胞增多16.89%，說(shuō)明細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期限制從G1期進(jìn)入S期，然后

18、阻滯于G2期，G2期的主要特征是RNA的合成和染色質(zhì)的螺旋化，此期對(duì)外界環(huán)境敏感，易受各種因素的影響6。提示根據(jù)藥物對(duì)膽管癌細(xì)胞周期各期的影響，在臨床上可以更好地選擇不同的化療藥物，聯(lián)合用藥以增加療效，減少副作用。在經(jīng)藥物作用篩選后1月，細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度仍明顯降低，證明了細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)了某種機(jī)制，該機(jī)制可以使腫瘤細(xì)胞耐受阿霉素的殺傷作用，但具體的機(jī)制需要進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)提示：（1）通過(guò)適當(dāng)劑量的間歇的持續(xù)的沖擊應(yīng)用抗腫瘤藥物，可以篩選出持續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞；（2）膽管癌細(xì)胞在阿霉素作用下，細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤藥濃度下降，這是腫瘤細(xì)胞在含抗腫瘤藥物的掊養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖的基礎(chǔ)；（3）阿霉素可以影響細(xì)胞的分裂增殖周期。但該結(jié)論尚需今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。    參  考  文  獻(xiàn)    1叢文銘，吳孟超，陳漢.肝內(nèi)膽管癌多基因變異表型分析J.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81：271273.    2Jokoby WB.Methods in enzymologyM.New York:Acad Pres