應(yīng)用多重RT-PCR檢測(cè)草莓斑駁病毒和草莓輕型黃邊病毒

1、園 藝 學(xué) 報(bào) 2006, 33(3 :507510應(yīng)用多重 RT -PCR 檢測(cè)草莓斑駁病毒和草莓輕型 黃邊病毒張志宏 楊洪一 3 代紅艷 李 賀 肖 敏(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 , 遼寧沈陽(yáng) 110161摘 要 :建立了多重 RT -PCR 同時(shí)檢測(cè)草莓斑駁病毒 (S MoV (S M YE V 的技 術(shù)體系 , 對(duì)草莓田間植株和試管苗都可以有效進(jìn)行檢測(cè)T m 值進(jìn)行篩選 。 適宜的 PCR 緩沖液的濃度為 2×, , 66 。分別利用單一 PCR 和多重 PCR 11。關(guān)鍵詞 :多重 RT -PCR; ; 草莓中圖分類(lèi)號(hào) :S 1S 432:A 文章編號(hào) :05132353X (

2、2006 0320507204D etecti on of m ottle v i rus and S traw berry m ild yellow edge virus by M ulti plex RT 2PCRZhang Zhihong, Yang Hongyi 3, Dai Hongyan, L i He, and Xiao M in(College of Horticulture, Shenyang A gricultural U niversity, Shenyang, L iaoning 110161, China Abstract:A multi p lex reverse

3、transcri p tase poly merase chain reacti on (RT -PCR assay was devel oped for si m ultaneously detecting Stra wberry mottle virus (S Mo V and S traw berry m ild yello w edge virus (S MY 2 EV . Both field 2gr own stra wberries and m icr op lants were detected effectively . The p ri m ers of multi p l

4、ex PCR were selected by p ri m er 2p ri m er interacti ons and melting te mperature . I n multi p lex PCR for detecting S MoV and S MYEV, the app r op riate concentrati on of PCR buffer was 2×, and the app r op riate te mperatures f or an 2 neal and extensi on were 57 and 66 res pectively . Ele

5、ven lines of stra wberry (F ragaria ×ananassa culti 2 var Hokowase , which were obtained by m ini shoot ti p culture in vitr o, were screened f or virus eli m inati on by standard RT -PCR and multi p lex RT -PCR.Key words:Multi p lex RT -PCR; V irus detecti on; Stra wberry病毒對(duì)無(wú)性繁殖的多年生草本植物草莓 (Fra

6、garia ×ananassa 危害嚴(yán)重 , 導(dǎo)致植株矮化 , 匍匐莖 減少 , 果實(shí)品質(zhì)變劣 , 減產(chǎn) 30%80%。 侵染草莓的 20多種病毒中草莓斑駁病毒 (Stra wberry mottle virus, S Mo V 和草莓輕型黃邊病毒 (S traw berry m ild yello w edge virus , S MYE V 分布較廣 , 危害較重。 解決病毒危害草莓生產(chǎn)的關(guān)鍵是大面積推廣應(yīng)用無(wú)病毒苗 , 實(shí)行無(wú)病毒化生產(chǎn) 。 病毒檢測(cè)手段是 病毒研究的一個(gè)重要環(huán)節(jié) 。 多重 PCR (Multi p lex poly merase chain reacti on

7、 是在 1次 PCR 反應(yīng)中加入 多于 1對(duì)的引物 , 特異性地?cái)U(kuò)增多個(gè)基因位點(diǎn)的反應(yīng) 。 與常規(guī)的單一 PCR 相比 , 多重 PCR 可以同時(shí) 檢測(cè)多種病毒或區(qū)分病毒的不同株系 , 極大地提高檢測(cè)效率 , 降低檢測(cè)成本 。 由于草莓病毒多為混合 侵染 , 綜合表現(xiàn)癥狀 , 利用單一 PCR 對(duì)多種病毒進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)的工作量較大 , 因而多重 PCR 在草莓 病毒檢測(cè)中的優(yōu)越性更為明顯 。本研究在利用單一 RT -PCR 檢測(cè) S MoV 和 S MYEV 的基礎(chǔ)上 1, 2 , 通過(guò)調(diào)節(jié)和優(yōu)化影響多重 RT -PCR 的因子 , 旨在探索建立利用多重 RT -PCR 技術(shù)同時(shí)檢測(cè) S MoV

8、 和 S MYE V 的技術(shù)體系 。 收稿日期 :2005-05-20; 修回日期 :2005-07-01基金項(xiàng)目 :國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (302001873通訊作者 Author f or corres pondence 園 藝 學(xué) 報(bào) 33卷1 材料與方法111 植物材料 、 試劑和引物春香 (Harunoka 、 高斯克 (Governor Si m coe 、布蘭登堡 (B randenburg 等草莓品種生長(zhǎng)于露 地 。 通過(guò)單一 RT -PCR 檢測(cè)證明帶有 S MoV 和 S MYEV 的草莓品種寶交早生 (Hokowase 生長(zhǎng)于溫 室 。 通過(guò) 015mm 微莖尖培養(yǎng)獲

9、得的寶交早生的 11個(gè)株系離體保存于 100mL 三角瓶中 。反轉(zhuǎn)錄酶 M 2MLV 為 I nvitr ogen 公司產(chǎn)品 , Taq DNA 聚合酶 (TaKaR a LA Taq T M 、 dNTPs 、 RNA 酶 抑制劑 、 DNA Marker 購(gòu)于 TaKaRa 公司 , 其它藥品為國(guó)產(chǎn)分析純 。根據(jù) Gen Bank 中 S MoV (登錄號(hào) AJ311875, AJ311876 S MYE 的基因組序 列和文獻(xiàn) 14 分別設(shè)計(jì)和合成針對(duì) S MoV 、 S B 專(zhuān)化內(nèi)標(biāo) 的引物 (表 1 。表 S M oVTable 1 er i n g segm en ts of S M

10、 oV, S MY EV and i n terna l con trol引物對(duì) Pri m er pairs 序列Sequence目的片段來(lái)源Source of target frag ment大小 Size (bp D1/D2 T AAGCG ACCACG ACTGTG ACAAAG (正義引物 Sense p ri m er ATTCGGTTCACGTCCT AGTCTCAC (反義引物 Antisense p ri m er S MoV461D1/D3 T AAGCG ACCACG ACTGTG ACAAAG (正義引物 Sense p ri m er TCTTGGGCTTGG ATC

11、GT CACCTG (反義引物 Antisense p ri m er S MoV219C1/C2 GG ACCT ACGG ATCTTGG AAGT (正義引物 Sense p ri m er ACCCGCACAACTTGTCGG AGG (反義引物 Antisense p ri m er S MoV461Y1/Y2 GTGTGCTCAATCCAGCCAG (正義引物 Sense p ri m er CATGGCACTCATTGG AGCTGGG (反義引物 Antisense p ri m er S MYEV271YT1/YT2 CCGCTGCAGTTGT AGGGT A (正義引物 Se

12、nse p ri m er TTTTTTTTTTTTTTT AAGG AAAAAG AAAAACAAAC (反義引物 Antisense p ri m er S MYEV932YT1/Y2 CCGCTGCAGTTGT AGGGT A (正義引物 Sense p ri m er CATGGCACTCATTGG AGCTGGG (反義引物 Antisense p ri m er S MYEV861N1/N2 GG ACTCCTG ACGT AT ACG AAGG ATC (正義引物 Sense p ri m er AAACAACGCTTGT AAGG AGTCC (反義引物 Antisense p

13、 ri m er ndh B571112 RNA 的提取和 RT -PCR從待檢測(cè)草莓植株上取幼嫩的葉片 , 采用 CT AB 法提取總 RNA 1 。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為 20L, 其 中包括模板 1L, 反轉(zhuǎn)錄酶 M 2MLV 60U, 隨機(jī) 9引物 (50mol L -1 和 OL I G O dT 引物 (50mol L -1 各 015L, 其它成分與操作步驟參考 I nvitr ogen 反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū) , 37 反轉(zhuǎn)錄 215h 。 取 1L 進(jìn)行 PCR 反應(yīng) , 反應(yīng)體積 20L, 含 115mmol L -1Mg Cl2, 012mmol L -1d NTPs, Taq 酶

14、1U 。 對(duì)于 單一 PCR 反應(yīng) , 緩沖液濃度為 1×, 引物為 012mol L -1; 對(duì)于多重 PCR 反應(yīng) , 緩沖液濃度為 2×, 引物對(duì) D1/D3、 Y1/Y2、 N1/N2的濃度依次為 0127、 0120和 0102mol L -1。 單一 PCR 反應(yīng)程序分 別為 :(1 引物對(duì) D1/D3,94 2m in, 94 30s, 55 40s, 72 60s, 35個(gè)循環(huán) , 最后 72 延伸 5m in; (2 引物對(duì) N1/N2的反應(yīng)程序與 D1/D3的相同 ; (3 引物對(duì) Y1/Y2的退火溫度為 56 , 其 它與 D1/D3的相同 。 多重

15、PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?:94 2m in; 94 30s, 57 40s, 66 2m in, 35個(gè) 循環(huán) ; 最后 72 延伸 5m in 。 用含 E B 的 116%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 。2 結(jié)果與分析211 多重 PCR 引物的篩選采用單一 RT -PCR 技術(shù) , 引物對(duì) D1/D2、 D1/D3和 C1/C2分別從感染 S MoV 的草莓植株中穩(wěn)定 805 3期 張志宏等 :應(yīng)用多重 RT -PCR 檢測(cè)草莓斑駁病毒和草莓輕型黃邊病毒 地?cái)U(kuò)增出 S MoV 的特異片段 1 ; 引物對(duì) Y1/Y2和 YT1/YT2分別從感染 S MYEV 的草莓植株中穩(wěn)定地 擴(kuò)增出 S M

16、YE V 的特異片段 2 ; 引物對(duì) N1/N2從草莓病毒指示植物和草莓品種的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴(kuò)增出 了 571bp 的 ndh B 基因特異片段 , 而未加反轉(zhuǎn)錄酶則沒(méi)有任何擴(kuò)增產(chǎn)物 , 說(shuō)明 ndh B 基因存在于草莓 中 , 跨越內(nèi)含子的引物設(shè)計(jì)是有效的 , ndh B 基因適合作為草莓 RNA 病毒檢測(cè)的內(nèi)標(biāo) 1 。引物對(duì) D1/D2的退火溫度為 50 , 遠(yuǎn)低于其它引物對(duì)的退火溫度 , 因而不宜作為多重 PCR 反應(yīng) 的引物 。 利用軟件 OM I G A 210對(duì)其它引物進(jìn)行引物互補(bǔ)性測(cè)試 , 發(fā)現(xiàn)引物 C12Y1、 C12YT1、 C12N1、 C12N2、 C22YT1、 C22Y

17、T2、 C22Y1間存在著較大的互補(bǔ)性 , 因此這些引物不適合互相組合來(lái)作為多重 PCR 反應(yīng)的引物 。此外 , 利用軟件 DNAMAN 計(jì)算引物 T m 值的結(jié)果表明 , D3、 Y1、 Y2、 N1、 N2的 T m 值較一致 。 基于此 , 本研究選擇引物對(duì) D1/D3、 Y1和 PCR 檢測(cè) S MoV 和 S MYEV 的引物 。 在相同的 PCR (m 54 40s, 72 2 m in, 35個(gè)循環(huán) ; 72 延伸 5m in 下 , (圖 1 。 212 引物濃度 、退火溫度和 PCR多重 PCR 反應(yīng)的影響以被 S MoV交早生為試材 , PCR 檢測(cè)S MoV 和 S MY

18、EV 的體系建立和優(yōu)化研究 。按照012mol L -1的終濃度等量加入引物 D1/D3、 Y1/Y2和 N1/N2,采用 50 的退火溫度 , 結(jié)果顯 示內(nèi)標(biāo)片段過(guò)強(qiáng) , S MoV 片段較弱 , 而且未能擴(kuò) 增出 S MYE V 片 段 。增 加 S MYEV 引 物 的 濃 度 (012016mol L -1 、降低內(nèi)標(biāo)引物的濃度 (01050115mol L -1 未能有效解決該問(wèn)題 ; 當(dāng) S MYEV 引物濃度提高至 018mol L -1時(shí) , 雖 能擴(kuò)增出 S MYEV 片段 , 但是有大量彌散的碎片 , 而且 S MoV 片段和內(nèi)標(biāo)片段消失 。圖 1 單一 PCR 中不同引物

19、對(duì)的擴(kuò)增M:DNA Marker DL2000; 1:利用引物對(duì) D1/D3擴(kuò)增 S MoV; 2:利用引物對(duì) Y1/Y2擴(kuò)增 S MYEV; 3:利用引物 對(duì) N1/N2擴(kuò)增內(nèi)標(biāo) 。F i g . 1 The am pli fi ca ti on w ith d i fferen t pr i m er pa i rs i n st andard PCRM:DNA marker DL2000; 1:Amp lificati on of S MoV with p ri m er pair D1/D3;2:Amp lificati on of S MYEV with p ri m er pair

20、 Y1/Y2;3:Amp lificati on of internal contr ol with p ri m er pair N1/N2. 當(dāng)引物濃度為 012mol L -1時(shí) , 對(duì)退火溫度和延伸溫度進(jìn)行調(diào)節(jié) 。 降低退火溫度至 46 , 擴(kuò)增 效果未見(jiàn)提高 ; 而提高退火溫度至 57 , 可以擴(kuò)增出 S MYE V 的特異片段 。在多重 PCR 反應(yīng)中 , 延 伸溫度也是重要的因素 , 高的延伸溫度 (72 可能更利于單一片段的擴(kuò)增 。因此 , 在退火溫度為 57 的條件下 , 對(duì)不同的延伸溫度 (6572 進(jìn)行試驗(yàn) , 結(jié)果表明延伸溫度為 66 時(shí)擴(kuò)增效果最 佳 , 且擴(kuò)增結(jié)果較

21、穩(wěn)定 , 但是短片段擴(kuò)增效果仍相對(duì)較差 。PCR 緩沖液濃度可以調(diào)節(jié)大小片段擴(kuò)增產(chǎn)物間的強(qiáng)弱 。由于高鹽濃度會(huì)影響長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物的 變性解鏈 5 , 通常長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物在低鹽濃度下擴(kuò)增效果較好 , 而短片段擴(kuò)增產(chǎn)物在高鹽濃度下擴(kuò) 增結(jié)果較好 。 在退火溫度為 57 、 延伸溫度為 66 的情況下 , 對(duì) PCR 緩沖液濃度 (015315× 對(duì) 擴(kuò)增效果的影響進(jìn)行比較 , 結(jié)果顯示 2×PCR 緩沖液最優(yōu) 。進(jìn)一步對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化 , 得到檢測(cè) S MoV 和 S MYEV 的多重 PCR 體系的最終優(yōu)化結(jié)果為 :加 入 2×PCR 緩沖液 , 引物 D1/D3

22、、 Y1/Y2和 N1/N2的濃度依次為 0127、 0120和 0102mol L -1。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 2m in; 94 30s, 57 40s, 66 2m in, 35個(gè)循環(huán) ; 最后 72 延伸 5m in 。 213 利用多重 RT -PCR 檢測(cè)草莓樣品利用多重 RT -PCR 對(duì)沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)草莓試驗(yàn)園露地保存的春香 、高斯克 、布蘭登堡進(jìn)行病毒檢 測(cè) , 結(jié)果表明均感染有 S MYEV 而沒(méi)有感染 S MoV 。對(duì)被 S MYEV 和 S MoV 混合侵染的寶交早生進(jìn)行微莖尖 (015mm 培養(yǎng)脫毒處理 , 然后對(duì)獲得的 11個(gè)株系分別利用單一 RT -PCR 和

23、多重 RT -PCR 進(jìn)行脫毒效果鑒定 。 結(jié)果顯示 , 單一 RT -PCR 和 905 園 藝 學(xué) 報(bào) 33卷多重 RT -PCR 進(jìn)行脫毒效果 檢測(cè) 的結(jié) 果一致 (圖 2 , 有 6個(gè)株系脫除了 S MoV 和 S MYE V , 有 3個(gè)株系僅脫除了 S MoV, 另兩個(gè)株系沒(méi)有脫毒 。3 討論單一 PCR 中效果極佳的引物作為多重 PCR 的 引物時(shí) , 很可能因?yàn)橐镩g相互作用而未能建立多重 PCR 體系 6 。 Bariana 等 7在檢測(cè)豆類(lèi)病毒中 , 加入內(nèi)標(biāo)引物后則多重 PCR 擴(kuò)增出較多非特異片 段 , 且未能通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系來(lái)解決。 因此 , 慎重 選擇引物可以使反應(yīng)

24、更容易優(yōu)化 , 片段時(shí)。 合理選擇引物后 , 不能良好地?cái)U(kuò)增是多重 5, 總體來(lái)講 , 提高 , 而增加延伸時(shí)間、 降低 PCR 緩沖液濃度可能增加長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。 在本研 究中 , 單獨(dú)增加某對(duì)引物的量對(duì)反應(yīng)的影響較復(fù) 雜 , 該引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物未必增加 , 且易引起其 它擴(kuò)增片段的缺失或彌散 , 即使擴(kuò)增產(chǎn)物增加了 , 其重復(fù)性也不好。 只有當(dāng)其它因子較適合時(shí) , 再調(diào)節(jié)引物的量才有較好的效果。圖 和多重 PCR 檢測(cè)草莓微莖尖組培苗 DL2000; 111:通過(guò)微莖尖培養(yǎng)獲得的草莓品種寶交早生的 11個(gè)株系。a:利用單一 PCR 檢測(cè) S MoV; b:利用單一 PCR 檢測(cè) S MY

25、EV;c:利用多重 PCR 檢測(cè) S MoV 和 S MYEV 。F i g . 2 Strawberry m i cropl an ts ar isen from m i n i shoot ti pculture were screened for v i rus eli m i n a ti on by st andardRT -PCR and m ulti plex RT -PCRM:DNA marker DL2000; 1-11:Eleven lines obtained by m ini shoot ti p culture of stra wberry cultivar Hoko

26、wase ; a:The detecti on of S MoV by standard RT -PCR; b:The detecti on of S MYEV by standard RT -PCR; c:The detecti on ofS MoV and S MYEV by multi p lex RT -PCR. 多重 PCR 比單一 PCR 中的退火溫度低 46 一般有更好的擴(kuò)增效果 , 短擴(kuò)增條帶弱或缺失多采用降低退火溫度來(lái)解決 5, 而本研究中提高退火溫度反而增加了弱帶的亮度 , 這可能在于高的退火 溫度抑制了長(zhǎng)內(nèi)標(biāo)片段的擴(kuò)增 , 從而利于短片段的擴(kuò)增 。 參考文獻(xiàn) :1 楊 洪

27、一 , 張志宏 , 杜國(guó)棟 , 代紅艷 , 高秀巖 . 利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的 RT 2PCR 技術(shù)檢測(cè)草莓斑駁病毒 . 植物病理學(xué)報(bào) , 2005, 35(2 :116122Yang H Y, Zhang Z H, Du G D, Dai H Y, Gao X Y . RT 2PCR detecti on Strawberry mottle virus based internal contr ol . Acta Phyt opathol ogica Sinica, 2005, 35(2 :116122(in Chinese 2 楊洪一 , 張志宏 , 高秀巖 , 杜國(guó)棟 , 代紅艷 , 李 賀

28、. 草莓輕型黃邊病毒的 RT 2PCR 檢測(cè)及其 3端序列分析 . 園藝學(xué)報(bào) , 2005, 32(3 :403407Yang H Y, Zhang Z H, Gao X Y, Du G D, Dai H Y, L i H. Detecti on of S traw berry m ild yello w edge virus with RT 2PCR and analysis of the sequences of 3ter m inal regi on . Acta Horticulturae Sinica, 2005, 32(3 :403407(in Chinese 3 Thomp s on J R, W etzel S, Klerks M M, Va kov áD, Schoen C D, pak J, Jelkmann W. Multi p lex RT 2PCR detecti on of f our aphid 2bornestrawberry viruses in F ragaria s pp. in combinati on with a p lant mRNA s pecific internal contr ol . Journal of V ir ol og