實(shí)時(shí)定量大腸癌組織中MK基因表達(dá)及其臨床意義

1、作者：李克強(qiáng) 陳功星 張佳煒 曹樹(shù)立 胡錫浩 【摘要】目的 利用實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）相對(duì)定量大腸癌組織中Midkine基因的表達(dá)，探討MK基因在大腸癌不同病理狀態(tài)中的意義。方法 提取34例臨床大腸癌組織及其癌旁正常組織中的總RNA，經(jīng)寡聚脫氧胸腺嘧啶逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR擴(kuò)增，以?xún)?nèi)標(biāo)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的mRNA相對(duì)定量MK基因的mRNA表達(dá)，比較癌組織與其癌旁正常組織中的MK表達(dá)差異。結(jié)果 34例樣本中癌組織較之癌旁正常組織，MK基因表達(dá)降低（P0.01）；其中在Du

2、cks分期中C期、女性組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、管狀腺癌和浸潤(rùn)漿膜層組中癌組織較之癌旁正常組織表達(dá)降低（P0.05），其余組大腸癌組織較之癌旁正常組織無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論 在大腸癌病程晚期癌組織中MK基因的表達(dá)水平降低。 【關(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)定量 PCR Midkine基因【Abstract】ObjectiveWith Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Midkinegene expression was relatively quantified in colorectal cancer samples. We di

3、scussed a relationship of MK expression and colorectal cancer. MethodsThe total RNA was extracted from 34 clinical samples of colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. The RNA was reverse transcripted into cDNA with oligodT. And the cDNA was amplified by RT-PCR. MK relative expre

4、ssion was quantified to an inherence gene Glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH). At last the different was analyzed between colorectal cancerous tissue and their adjacent normal tissue. ResultIn the 34 samples MK mRNA of the colorectal cancerous tissue is less than that of the adjacent normal tissue (P

5、0.01). And the same situation is MK mRNA in the14 C-phase samples, the female, the transferred lymphaden, the tubular adenocarcinoma and the invasive subserous groups (P0.05). But there is no statistical signification （P0.05）in the other groups. ConclusionMK expresses lowly in the colorectal cancer

6、of late stage. 【Key words】Real-time QuantitativePCRMidkine gene 大腸癌在我國(guó)近幾年發(fā)病率上升，5年生存率在60左右，但治療效果30年來(lái)無(wú)顯著提高1。大腸癌發(fā)生機(jī)制相對(duì)于其它腫瘤的發(fā)生機(jī)制來(lái)說(shuō)較為清楚，但仍有很多問(wèn)題尚未解決，特別是早期發(fā)生階段的機(jī)制還不清楚,應(yīng)用基因分析手段檢測(cè)相關(guān)基因的異常變化有可能在早期診斷和預(yù)后判斷上發(fā)揮作用2。Midkine（MK）基因是日本學(xué)者Kadomatsu等3運(yùn)用差異雜交的方法，從視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎腫瘤HM-1細(xì)胞株cDNA文庫(kù)中篩選出的一個(gè)新基因，在多種腫瘤患者血清中高表達(dá)4，尤其是在肝癌組織中

7、的表達(dá)，肝癌組織惡化時(shí)表達(dá)增加，肝癌組織惡性程度低時(shí)表達(dá)少5，此外，MK基因在早期大腸癌變組織中也是表達(dá)升高的6，但晚期的表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道，作者自2006年5月至2007年12月利用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）技術(shù)，對(duì)臨床大腸癌樣本進(jìn)行分析，觀察MK基因在大腸癌組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討MK基因表達(dá)mRNA水平與大腸癌病理過(guò)程的關(guān)系。 1材料和方法 1.1樣本的采集34例大腸癌及其癌旁正常組織標(biāo)本隨機(jī)取自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科、普通外科手術(shù)患者，其中男17例，女17例；年齡2584歲，平均62.1歲，經(jīng)病理檢查確定。 1.2試劑和儀器引物設(shè)計(jì)為跨目的基因內(nèi)含子、含兩

8、個(gè)外顯子部分堿基的序列，并經(jīng)blastn基因庫(kù)搜索，符合引物常規(guī)設(shè)計(jì)要求，熒光素標(biāo)記為PCR儀器所要求：MK基因上游引物：5-GCGCGCTACAATGCTCAGT-3，下游引物：5- CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT-3，探針：5-FAM CCAGGAGACCATCCGCGTCACC TRMAR-3（上海生物工程公司合成），含甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因上、下游引物和VIC標(biāo)記探針的20Human GAPDH、2PCR master mix、dNTPs購(gòu)于PE公司。Trizol、5Strand buffer、0.1M DTT、SSTR為GIBCO產(chǎn)品，OligodT由上海

9、生物工程公司合成。主要設(shè)備RTPCR反應(yīng)儀7700 Sequence Detector ABI PRISM(PE公司)。 1.3總RNA提取分別取手術(shù)后離體大腸癌組織、癌旁正常組織各約100mg，在液氮環(huán)境下?lián)v碎并研磨成粉，迅速置于1.5ml的eppendorf 管中，加1ml的Trizol液，反復(fù)吹打約10min，加0.2ml氯仿，用力振蕩混勻，冰浴10min后, 低溫12000g離心15min，吸取上清液置另一eppendorf 管中，加0.5ml異丙醇混勻，室溫沉淀10min， 12000g離心10min, 棄上清液,沉淀加75%乙醇1ml洗滌1次，待酒精揮發(fā)干后溶于適量0.1%的焦碳酸

10、二乙酯(DEPC)水中，-20保藏備用。 1.4逆轉(zhuǎn)錄cDNA取10l的RNA，加入1l的50M OligodT，70變性10min，立即置冰上2min，離心。然后加入9l混合試劑：4l 5Strand bufer、2l 0.1M DTT、1l dN(A,T,C,G)TP、1l RNase inhibitor、0.5l SSTR2、0.5l 1%的DEPC水，在42水浴52min，然后70水浴15min終止反應(yīng)，加80l水混勻置-20冰箱保存。 1.5RT-PCR50l反應(yīng)體系中分別含有MK基因上、下游引物各0.3M、探針0.2M；2.5l 20Human GAPDH、25l 2PCR mas

11、ter mix、10l cDNA。然后在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為：50預(yù)變性2min；95變性10min；95變性30s；60退火1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。在指數(shù)期內(nèi)采集，根據(jù)儀器使用指南及實(shí)際情況，設(shè)定參數(shù)值，得到每個(gè)PCR反應(yīng)的CT（Cycle Threshold）值，即模板cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增達(dá)到某一熒光強(qiáng)度的循環(huán)次數(shù)。 1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MK表達(dá)的mRNA是以同一組織中內(nèi)標(biāo)GAPDH的表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)7進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算轉(zhuǎn)換，得到的相對(duì)GAPDH校正值，一式三份用均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差（xSD）表示，根據(jù)樣本來(lái)源，及臨床患者不同生理病理特征，參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道8分別列成6個(gè)大組，又在每

12、組中再分成不同特征的小組，對(duì)癌組織和癌旁組織之間，用SPSS(13.0版)軟件進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用t檢驗(yàn)。 計(jì)算公式： cDNAMK2CTMKcDNAGAPDH2CT GAPDH cDNAMKcDNAGAPDH2CT(CT =CT GAPDHCT MK) cDNAMK表示MK基因的cDNA量，cDNAGAPDH表示GAPDH基因的cDNA量，CT GAPDH（或CT GAPDH）以及CT MK（或CT MK）表示cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增到指數(shù)期時(shí)一定量的理想循環(huán)數(shù)。 2結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)的基因，是電腦監(jiān)控下的每個(gè)樣本基因DNA逐步倍增變化的整個(gè)過(guò)程（圖1），以每次

13、PCR循環(huán)結(jié)束后熒光的強(qiáng)度代表基因的產(chǎn)量，在圖中為曲線鏈接的點(diǎn)，每種基因在一個(gè)圖中顯示，每條曲線代表一個(gè)樣本中檢測(cè)基因DNA在整個(gè)PCR過(guò)程中倍增量的變化，樣本中基因DNA含量以在圖中的位置表現(xiàn)，樣本基因DNA含量越少，曲線逐漸右移。在指 圖1cDNA聚合酶鏈反應(yīng)倍增全過(guò)程 注：、B分別為樣本中GAPDH基因與MK基因表達(dá)mRNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA聚合酶鏈反應(yīng)倍增全過(guò)程。橫軸為Cycle，即PCR循環(huán)數(shù)，每一單位表示一次PCR循環(huán)，縱軸為熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值（n），即每次PCR循環(huán)后當(dāng)時(shí)的所有熒光強(qiáng)度與本底的差值，每一條曲線表示一個(gè)樣本中單一基因PCR反應(yīng)的全過(guò)程，整個(gè)曲線變化與普通PCR變化過(guò)程相

14、同，有三個(gè)區(qū)域，依次為基數(shù)期、指數(shù)期和平臺(tái)期。 表1大腸癌組織及其癌旁正常組織中MK基因表達(dá)的mRNA 組別nmRNA水平(xSD)癌組織癌旁正常組織P值年齡（歲） 4040.060.040.330.220.10 4164100.110.20.210.190.13 65200.120.160.210.180.07性別 男170.150.210.20.180.40 女170.060.090.250.190.00病理類(lèi)型 乳頭狀腺瘤50.150.260.260.170.44 管狀腺癌200.130.170.240.20.02 黏液腺癌30.050.060.180.230.48 其它類(lèi)型50.040

15、.020.150.150.15 混合型10.010.07淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性180.120.170.210.190.06 陽(yáng)性160.10.160.240.190.02浸潤(rùn)程度 黏膜下層10.040.27 肌層90.240.260.30.220.57 漿膜層240.060.080.190.170.00Ducks分期 A40.180.270.30.150.41 B140.10.140.180.20.11 C140.090.160.250.190.02 D20.150.210.150.21合計(jì)340.110.160.220.190.00 注：P值為該組癌組織與癌旁正常組織兩類(lèi)樣本中MK表達(dá)mRNA水平

16、的t檢驗(yàn)，混合型是指病理觀察中同時(shí)存在2種或2種病理類(lèi)型的癌組織 數(shù)期內(nèi)采集原始數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正，每個(gè)樣本中癌組織及其癌旁組織相對(duì)定量MK的表達(dá)的mRNA水平，根據(jù)樣本來(lái)源的不同生理病理特征分組（表1）。年齡組中分為青、中、老三小組，癌組織較之癌旁正常組織中MK表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；病理類(lèi)型中管狀腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及Dukes分期中C期中MK表達(dá)，癌組織低于其癌旁正常組織（P0.05）；而性別中女性患者組、腫瘤浸潤(rùn)至漿膜層組及總體樣本中，癌組織明顯低于其癌旁正常組織MK表達(dá)（P0.01）。此外，由于樣本收集的不足，病理類(lèi)型中的混合類(lèi)型、浸潤(rùn)黏膜層和與Dukes分期D期不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

17、析。其余組中癌組織較之癌旁正常組織中的MK表達(dá)值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 3討論 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR），通過(guò)測(cè)試mRNA逆轉(zhuǎn)錄后cDNA的含量，從而定量分析基因表達(dá)情況，其高通量、簡(jiǎn)捷在基因研究與應(yīng)用的許多方面具有重要作用9，也是臨床診斷分析的一個(gè)手段。由于實(shí)時(shí)定量PCR的直觀效果，檢測(cè)者可直接監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程的全過(guò)程（圖1），避開(kāi)PCR反映過(guò)程中表現(xiàn)不合實(shí)際的基數(shù)期和平臺(tái)期，及由于儀器設(shè)備客觀原因出現(xiàn)的錯(cuò)誤，從指數(shù)期中采集到理想數(shù)據(jù)。RT-PCR使用的參照標(biāo)準(zhǔn)有外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)2種，作者是以同一樣本中的GAPDH為內(nèi)標(biāo)，在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)目的基因和內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)，以此內(nèi)標(biāo)相對(duì)定量本

18、樣本中目的基因MK的表達(dá)，客觀又簡(jiǎn)便。此外，本組樣本，每個(gè)患者均同時(shí)采集癌組織及其癌旁正常組織，檢測(cè)兩份樣本，統(tǒng)計(jì)分析的是同一患者樣本中癌組織與其癌旁正常組織中MK基因的表達(dá)，可客觀反映異常組織基因表達(dá)的實(shí)際情況。使用該方法，分析了34例大腸癌臨床樣本癌組織及其癌旁正常組織MK基因的表達(dá)，從收集的樣本分布看（表1），在Dukes分期組中大部分是B、C期，加上D期的2例，中、晚期樣本占大多數(shù)，這符合中國(guó)的國(guó)情，中國(guó)患者早期預(yù)防不充分，至出現(xiàn)不適癥狀后就醫(yī)，大多數(shù)患者已至中、晚期，臨床上隨機(jī)收集的樣本也體現(xiàn)了這一特色。本研究表明總體樣本癌組織較與癌旁正常組織中的MK表達(dá)水平降低（P0.01），這與

19、Ye等6報(bào)道的MK表達(dá)情況不一致，該文分析了20例大腸癌前期病變的腺瘤組織中，MK基因表達(dá)升高。本資料34例樣本不同生理病理分組體現(xiàn)早期特征的樣本中，病理分類(lèi)組中乳頭狀腺瘤5例，浸潤(rùn)程度組中黏膜下層1例，Ducks分期組中A期4例，均占總體樣本的少部分，其中可統(tǒng)計(jì)分析的小組中，癌組織較之癌旁正常組織無(wú)顯著性差異（P0.05）,推測(cè)可能由于樣本數(shù)量的原因，尚須進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行分析來(lái)反映國(guó)人這方面的情況。但不同病理特征分組中體現(xiàn)大腸癌晚期癌特征的小組樣本，占總體樣本的大部分，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽(yáng)性、浸潤(rùn)程度組中深層組織漿膜層及Dukes分期組中C期等小組樣本中，MK基因的表達(dá)癌組織較為癌旁正常

20、組織降低（P0.05），與總體樣本反應(yīng)的結(jié)果一致，表明大腸癌晚期的MK基因表達(dá)是降低的，這為大腸癌的臨床診治和研究提供參考。至于MK基因表達(dá)在女性組中的差異（P0.01），尚待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 鄭樹(shù).大腸癌防治現(xiàn)場(chǎng)研究.中國(guó)腫瘤,2005,l4(6):352354.2 殿春.大腸癌分子生物學(xué)研究進(jìn)展.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2006.26(24)：9241927.3 Kadomatsu K, Tomomura M, Muramatsu T. cDNA cloning and sequencing of a new gene intensity expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in mid-gestation period of mouse embryogenesis. Biochem Biophys Res Commun, 1988,151:13121318.4 Ikematsu S, Yano A, Aridome K,