分子試驗(yàn)思路及方法

1、一、 整體試驗(yàn)思路：二、 具體實(shí)驗(yàn)方法：（一） RNA提取方法：Unizol 法：1 0.1g樣品加1ml 提取緩沖液（Unizol），搖晃，放到冰里。2 勻漿：勻漿器用之前要先用DEPC水清洗，再用無水乙醇清洗。3 分別取勻漿液到新管中，蓋好，做好標(biāo)記。12000g 28 離心10min。4 取上清液到另一個(gè)離心管中，室溫靜置5min。5 按每ml提取液加入200ul氯仿（三氯甲烷）。劇烈震蕩15秒，室溫靜置2-5min.6 12000g 28 離心15min。7 取上清，按每ml提取液加入500ul異丙醇，混勻。-20 靜置2h。8 12000g 28 離心10min。9 去掉上清，加入7

2、5%酒精 1ml（該酒精要用DEPC水稀釋），7000g 離心 7min。10 去掉上清，干燥。11 加入20ul或30ul DEPC水溶解。12 取5ul電泳檢測，1ul測定濃度及純度，其余的-80度冰箱保存或直接反轉(zhuǎn)錄。Aidlab RNA提取試劑盒：（快速、效果好些）1 勻漿：組織<20mg 加350ul，組織2030mg 加600ul 裂解液RLTplus，電動(dòng)勻漿2040秒。2 將勻漿后裂解物13000rpm 離心3min，將上清液全部加到DNA清除柱上。3 立刻13000rpm離心60秒，保留過濾液。（確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留）4 用移液槍精確估計(jì)濾液體積，加入

3、一般體積的無水乙醇，此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀，但不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。5 立即將混合物（每次小于700ul，多余的可分為兩次）加入一個(gè)吸附柱RA中，13000rpm 離心30秒，棄掉廢液。6 加700ul 去蛋白液 RW1，室溫放置1min，12000rpm 離心30秒，棄掉廢液。7 加500ul 漂洗液RW，12000rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500ul漂洗液RW重復(fù)一遍。8 將吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm 離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。9 取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free 離心管中，在吸附膜的中間部位加3050u

4、l RNase free water，室溫放置1min，12000rpm 離心1min。10 若想使RNA濃度高，可將第一次的洗脫液加回柱子，重復(fù)一遍。（二） 反轉(zhuǎn)錄：Takara 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒：5×PrimeScript Buffer 2ulPrimeScript RT Enzyme Mix1 0.5ulOligo dT Primer 0.5ulRandom 6 mers 0.5ulTotal RNA 按說明書要求濃度添加RNase Free dH2O 加水補(bǔ)齊至總體積為10ul（注：可成倍擴(kuò)大體系）反應(yīng)條件：37 15min85 5 sec（三） PCRPCR反應(yīng)體系：H2O

5、 11.6uldNTP mixture 3.2ulPCR buffer 2ulcDNA 1ul正向引物 1ul反向引物 1ulTaq 酶 0.2ul 共：20ulPCR反應(yīng)條件：1 94 4min2 94 30sec3 52 45sec （該步退火溫度可變）4 72 1min5 Go to 2 cycles 296 72 10min7 4 forever（四）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Takara 公司 SYBR Premix Ex Taq 試劑盒：內(nèi)參基因：一般為-actin。目的基因與內(nèi)參基因各做3個(gè)平行。引物設(shè)計(jì)要求：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：80150bp最為合適（可延長至300bp）引物長度：1

6、725 mersGC含量：4060% （4555%最佳）Tm值：正反向引物Tm值不能相差太大 OLIGO：6368 Primer 3：6065引物序列： A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC rich 或AT rich（特別是3端）。盡量避開T/C 或A/G的連續(xù)結(jié)構(gòu)。3末端序列：避免GC rich 或AT rich。3端堿基最好為G或C。盡量避免3末端堿基為T ?；パa(bǔ)序列：避開引物內(nèi)部或兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。兩條引物間的3末端避開有2個(gè)以上的互補(bǔ)序列。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq (2×) 10ulPCR正向引物(10uM) 0.4ul

7、PCR反向引物(10uM) 0.4ulcDNA模板 2uldH2O 7.2ul 共20ul程序：1 95 30s2 94 15s3 58 20s4 72 20s + Plate read5 Go to 2 ， 39 more times6 Melt curve 60.0 to95.0, increment 0.5 for 0.05s + plate read7. End（五）基因全長的擴(kuò)增：引物設(shè)計(jì)要求：1. 引物長度 2328nt2. GC含量： 5070%3. Tm值>=65,最好是>704. 3端不要跟試劑盒中的UPM引物互補(bǔ)5. 與目的基因互補(bǔ)配對(duì)Race cDNA 的反轉(zhuǎn)

8、錄：采用Clontech 的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒 （Takara 公司就可以買到）所有都在冰上加樣，加完震蕩混勻，再用mini-Spin 收集，最后加酶。1 3-race及5-race均做以下mix，每10ul cDNA 合成反應(yīng)加：5×First-Strand Buffer 2ulDTT (20mM) 1uldNTP Mix (10mM) 1ulTotal 4ul2. 5-RACE 3-RACERNA 12.75ul (10ng1ug) RNA 13.75ul5-CDS Primer A 1ul 3-CDS Primer A

9、 1ulSterile H2O 補(bǔ)齊 Sterile H2O 補(bǔ)齊Total 3.75ul Total 4.75ul3. 混好，收集，72 3min， 42 2min。4 冷卻后 14000g 離心10s，收集到底部。5 5-RACE 加1ul SMARTer A oligo 每個(gè)反應(yīng)。6 以上4.75ul 3及5-RACE cDNA 加以下試劑： 第一步混好的 Buffer mix 4ul RNase Inhibitor (40U/ul) 0.25ul SMARTScribe Reverse Transcriptase (100U) 1ul 共：10ul。7 輕輕地用移液槍混勻，收集到管底。

10、8 42 90min， 70 10min。9 用Tricine-EDTA Buffer 稀釋：總RNA <=200ng，加20ul總RNA >=200ng，加100ul10 cDNA 在-20 可保存3個(gè)月。RACE PCR 反應(yīng)體系：（采用Takara 公司的 Ex HotStar 酶）ddH2O 15.37ul10×Ex HotStar Buffer 2.5ul10×UPM 2.5uldNTP (2.5mM) 2ulcDNA 2ul引物 （10uM） 0.5ulEx HotStar Taq 酶 0.13ul 共：25ulRACE PCR 反應(yīng)程序：1 如果引物Tm值>70，最好用下面的Touch down 程序（特異性高）Touch down 程序：5 cycles： 94 30