分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化

1、實(shí)驗(yàn)三 感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化原理2熟悉感受態(tài)細(xì)菌的制備和轉(zhuǎn)化步驟二、實(shí)驗(yàn)原理1感受態(tài)細(xì)胞與轉(zhuǎn)化感受態(tài)指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70保存（有效期6個(gè)月）。轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方

2、法。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（CaCl2法），該法最先是由Cohen于1972年發(fā)現(xiàn)的。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板

3、上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到51062107轉(zhuǎn)化子/g質(zhì)粒DNA，可以滿足一般的基因克隆試驗(yàn)。如在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高1001000倍。除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到1091010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA。 2. 藍(lán)白斑篩選野生型大腸桿菌產(chǎn)生的-半乳糖苷酶（lacZ）能將無色的化合物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indoly

4、l-b- D-galactoside, X-Gal）切割成半乳糖和深藍(lán)色化合物5-溴-4-靛藍(lán)，使得整個(gè)培養(yǎng)的菌落產(chǎn)生顏色的變化變?yōu)樗{(lán)色。設(shè)計(jì)使用藍(lán)白篩選的工程菌為-半乳糖苷酶（lacZ）缺陷的菌株，這種菌株中-半乳糖苷酶（lacZ）的染色體DNA發(fā)生突變，造成其編碼的-半乳糖苷酶（lacZ）失去N端得146個(gè)氨基酸的短肽（-肽）。從而不具有生物活性，即無法作用于X-Gal而產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。用于藍(lán)白篩選的載體（如PUC系列）具有一個(gè)稱為lacZ，的基因，該基因包括：一段編碼-半乳糖苷酶（lacZ）的啟動(dòng)子，編碼-肽的序列，一個(gè)多克隆區(qū)域（MCS）。MCS位于編碼-肽的序列的區(qū)域中，是外源性DNA

5、的插入位點(diǎn)。雖然使用藍(lán)白篩選的工程菌因?yàn)槿笔Я薔端得146個(gè)氨基酸而不具有生物活性，但如果該菌株含有帶有l(wèi)acZ，的質(zhì)粒以后，則質(zhì)粒表達(dá)的N146個(gè)氨基酸和菌株染色體DNA表達(dá)的缺乏N端146個(gè)氨基酸的-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具有與完整的-半乳糖苷酶相似的作用，能將X-Gal分解為藍(lán)色物質(zhì)。X-gal藍(lán)色化合物b-半乳糖苷酶細(xì)菌感受態(tài)制備1 將TOP10菌體培養(yǎng)過夜后，以1:100比例接種，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，于冰浴30min，分裝EP管中，2500rpm，4離心5 min2 棄上清，沉淀加入1ml預(yù)冷0.1mol/LCaCl2重懸，置冰浴15 min，2500rpm 4 離心5 min3 棄上清，沉淀加入0.2ml預(yù)冷0.1mol/LCaCl2輕輕懸浮（此時(shí)細(xì)菌易破碎），置冰浴。轉(zhuǎn)化：1 加入質(zhì)粒DNA20ul，冰浴30min2 42 熱沖擊2min后，迅速冰浴2min以上3 加入 800ul Amp-LB培養(yǎng)基，37 培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)，250rpm/min4 取一Amp+LB平板，分別用40ul