miRNA 及其熒光定量PCR檢測

1、 microRNA 及其Real time PCR檢測北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司 microRNA,A hot zone of research!2009年2010年 microRNAmicroRNA （miRNA ）長度2024nt 單鏈小分子RNA廣泛存在于各種真核細(xì)胞中不編碼任何蛋白質(zhì)其基因常位于基因組非編碼區(qū)內(nèi)源性表達(dá)，表達(dá)具時(shí)序性和組織特異性。與目標(biāo)基因mRNA 相互作用，調(diào)控其表達(dá)水平在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、死亡等生物過程中起著重要的作用 分子功能22 nt單鏈小RNA與目標(biāo)基因3端非編碼區(qū)的識別位點(diǎn)相結(jié)合導(dǎo)致目標(biāo)基因mRNA 分子穩(wěn)定性下降，半衰期變短，或mRNA 分子結(jié)構(gòu)變化

2、（5脫帽），從而表達(dá)水平下降miRNA 作用靶點(diǎn)mRNA 5cap編碼區(qū)AAAAAAAA 3 microRNA 的來源 miRNA 前體與成熟體 microRNA 識別靶點(diǎn)不嚴(yán)格互補(bǔ)配對一個(gè)miRNA 可調(diào)節(jié)多個(gè)基因一個(gè)基因可受多個(gè)miRNA 調(diào)控60%人類蛋白基因受miRNA 調(diào)控 miRNA 與siRNA 的異同分子形式無區(qū)別，都是由Dicer 產(chǎn)生的22nt小分子分子功能近似，都導(dǎo)致目標(biāo)基因表達(dá)水平下降。但通常siRNA 效果更劇烈產(chǎn)生來源不同。miRNA 有其基因，內(nèi)源性表達(dá)siRNA 多數(shù)情況下為人工外源導(dǎo)入 miRNA siRNA 命名規(guī)則成熟體microRNA 命名規(guī)則micro

3、RNA 成熟體傳統(tǒng)名字：如let7家族成員：加a ，b, c后綴，如let-7a 主要產(chǎn)物：種名-miR-序號, 如，has-miR-56次要產(chǎn)物：加星號后綴，如，has-miR-56*主次不明：以5或3端區(qū)分，如，miR-142-5p (5 端產(chǎn)物 和miR-142-3p (3端產(chǎn)物arm (老命名miR-142-s and miR-142-as. miRNA 分子功能總結(jié)以非嚴(yán)格互補(bǔ)配對方式識別靶基因3端非翻譯區(qū)，只有8nt的種子區(qū)（seed region）嚴(yán)格互補(bǔ)配對。一種miRNA 分子可以不同威力調(diào)控多個(gè)靶基因，通常導(dǎo)致靶基因mRNA 穩(wěn)定性降低及其它翻譯水平的表達(dá)下降（如，脫帽）。

4、通常不導(dǎo)致mRNA 劇烈降解。有個(gè)別報(bào)告miRNAs 與5端非翻譯區(qū)結(jié)合導(dǎo)致靶基因上調(diào)表達(dá)。在植物中miRNA 的分子功能可與siRNA 相似，與目標(biāo)靶點(diǎn)嚴(yán)格互補(bǔ)配對，導(dǎo)致目標(biāo)基因mRNA 分子急劇降解。 2010年初數(shù)據(jù)庫（v.14）包括物種：115人miRNA ：721小鼠miRNA: 579大鼠miRNA ：325擬南芥miRNA ：1902011年初數(shù)據(jù)庫（v.16）包括物種：142人miRNA ：1048小鼠miRNA : 672大鼠miRNA ：408miRBase version 14擬南芥miRNA ：213miRNA annotationA uniform system fo

5、r microRNA annotation. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T. RNA2003 9(3:277-279 Expression criteriaA. Detection of a distinct 22-nt RNA transcript by hybridization to a size-fractionated RNA

6、sample (ordinarily by the Northern blotting method.B. Identification of the 22-nt sequence in a library of cDNAs made from size-fractionated RNA. Such sequences must precisely match the genomic sequence of the organism from which they were cloned (except as noted below.Biogenesis criteriaC. Predicti

7、on of a potential fold-back precursor structure that contains the 22-nt miRNA sequence within one arm of the hairpin. In this criterion, the hairpin must be the folding alternative with the lowest free energy, as predicted by mfold (Mathews et al. 1999 or another conventional RNA-folding program, an

8、d must include at least 16 bp involving the first 22 nt of the miRNA and the other arm of the hairpin. It should not contain large internal loops or bulges, particularly not large asymmetricbulges. In animals, these fold-back precursors are usually about 6080 nt, whereas in plants, they are more var

9、iable, and may include up to a few hundred nucleotides.D. Phylogenetic conservation of the 22-nt miRNA sequence and its predicted fold-back precursor secondary structure. The conserved hairpin should meet the same minimal pairing requirements as in criterion C, but need not be the lowest free energy

10、 folding alternative.E. Detection of increased precursor accumulation in organisms with reduced Dicer function. miRNA 檢測與定量經(jīng)典方法:放射標(biāo)記Northern 雜交 miRNA 芯片基因表達(dá)譜基本原理：某物種全部已知miRNA 集中于一張芯片。點(diǎn)雜交檢測各miRNA 豐度所回答的問題：哪些miRNA 是你所應(yīng)該關(guān)注的優(yōu)點(diǎn)：高通量，全景觀察缺點(diǎn)：敏感度、特異性均有限，適用于初篩需后續(xù)驗(yàn)證：qPCR miRNA 主要檢測技術(shù) Pri-miRNA 檢測必要性：不排除miRNA 從

11、前體到成熟體，從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到核外的過程中存在調(diào)控機(jī)制的可能。 Specific miRNA quantification by real time PCR way to go關(guān)鍵難點(diǎn)太短解決辦法: 加長豐度低解決辦法:小RNA 提取序列高度相似miRNA 之間難以區(qū)分解決辦法: 特殊設(shè)計(jì)的檢測方法；小心設(shè)計(jì)引物與反應(yīng)優(yōu)化 解決miRNA 豐度難題-小RNA 提取基本原理影響RNA 分子與硅膠柱結(jié)合的因素chaotropic agent ，如，鹽酸胍離子強(qiáng)度，如NaCl小分子有機(jī)溶劑，如乙醇精心調(diào)整各組份配比，達(dá)成大、小RNA 與硅膠柱結(jié)合的區(qū)分條件，分離去除大分子量RNA ，富集小分子量RNA

12、。 提取小分子量RNAM ：Marker#1：康為柱式分離的小片段RNA#2：康為柱式分離的總RNA#3：沉淀法得到的總RNA 成熟miRNA qPCR檢測-Poly(A加尾法優(yōu)點(diǎn)：簡單直接，高效。一次逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 可用于多個(gè)目標(biāo)分子的檢測。成熟miRNA qPCR檢測 莖環(huán)法優(yōu)點(diǎn)：特異引物逆轉(zhuǎn)錄，理論上效率更高，檢測更靈敏缺點(diǎn)：莖環(huán)引物設(shè)計(jì)復(fù)雜；特異引物逆轉(zhuǎn)錄不便多基因檢測 檢測方法選擇依樣本特性，檢測目標(biāo)多寡而定康為技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)舉例：復(fù)旦大學(xué)某客戶miRNA 芯片提示10個(gè)miRNA 在病人與正常人之間有顯著差異表達(dá)要求從66個(gè)外周血RNA 樣本中檢測這10個(gè)miRNA 加尾法，5

13、個(gè)目標(biāo)獲得良好檢測頸環(huán)法，4個(gè)目標(biāo)獲得良好檢測1個(gè)目標(biāo)的檢測很難，嘗試多種引物設(shè)計(jì)，調(diào)整反應(yīng)體系 其它檢測原理 其它檢測原理 microRNA 檢測難題 康為miRNA 產(chǎn)品小RNA 提取試劑盒CW0627加尾法miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒CW2141miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒CW2142熒光定量技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目 熒光定量PCR服務(wù)項(xiàng)目 熒光定量PCR服務(wù) 相對定量 -SYBR Green 染料法 相對定量 -TaqMan 探針法 絕對定量 - TA克隆制備標(biāo)準(zhǔn)品 miRNA熒光定量服務(wù) miRNA熒光定量 - 加尾法（SYBR Green法） miRNA熒光定量 - 莖環(huán)法（SYBR Green法） miRNA熒光定量 - 莖環(huán)法（TaqMan法） 熒光定量技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢 p 熒光定量PCR康為世紀(jì)擁有五臺世界主流的熒光定量PCR儀。 ABI7500（兩臺）、ABI7900、Roche480（