大鼠組織因子(TF)酶聯(lián)免疫分析

1、大鼠組織因子(TF)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號(hào)：CSB-E07914r檢測(cè)范圍：6.25 pg/ml - 400 pg/ml最低檢測(cè)限：2 pg/ml特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的大鼠TF，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。有效期：6個(gè)月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定大鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中TF含量。說明 1試劑盒保存：-20（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8（頻繁使用時(shí)）。2濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。4剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造

2、成任何影響。概述TF是一個(gè)分子量為47 kD，由263個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈跨膜糖蛋白，其基因定位于染色體1p211p22，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。TF按細(xì)胞表面抗原命名為CD142，屬類細(xì)胞因子超家族成員，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TF由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：(1)胞外區(qū)由219個(gè)氨基酸殘基所組成，包括2個(gè)二硫鍵及4個(gè)結(jié)合F/Fa的關(guān)鍵氨基酸殘基，后者是啟動(dòng)外源性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵部位。(2)跨膜區(qū)是一個(gè)由23個(gè)氨基酸殘基組成的疏水結(jié)構(gòu)，與磷脂緊密結(jié)合，功能尚未明確。(3)胞內(nèi)區(qū)由21個(gè)氨基酸殘基組成，其中存在3個(gè)與TF功能活性關(guān)系密切的絲氨酸殘基，能被活化的蛋白激酶C(PKC

3、)磷酸化而激活。TF又稱因子，是絲氨酸蛋白酶凝血因子F/Fa的膜受體，與F結(jié)合促使其轉(zhuǎn)化為Fa，并形成TF/a復(fù)合體。TF/Fa復(fù)合體進(jìn)一步將無活性的F水解為有活性的Fa，F(xiàn)a與Fa相結(jié)合并在活化血小板磷脂膜表面將凝血酶原酶解為凝血酶而啟動(dòng)外源性凝血過程。表達(dá)TF的單核細(xì)胞微粒通過其P選擇素糖蛋白配體(PSGL-1)與血小板P選擇素(P-selectin)相互作用而與活化血小板結(jié)合，在血栓形成過程中起重要作用。TF廣泛表達(dá)于各種組織細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等。正常生理狀態(tài)下TF在細(xì)胞表面處于非激活狀態(tài)，血液中血小板及單核細(xì)胞不表達(dá)TF，活化TF的濃度可能在20 fmol/

4、L以下。在炎癥、腫瘤、缺氧等病理狀態(tài)下，諸多活性物質(zhì)如組胺、腫瘤壞死因子(TNF-)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)等均可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF。研究表明，TF在胰腺癌、乳腺癌、急性白血病及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞表面及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)均異常增高，參與腫瘤生物學(xué)行為發(fā)生及腫瘤微環(huán)境形成。較之非上皮來源惡性腫瘤，上皮組織來源的癌細(xì)胞表達(dá)更高的TF。Guan等對(duì)34例神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究表明，瘤組織TF在蛋白和基因水平表達(dá)均明顯增加，并且隨腫瘤分級(jí)增高而增加，但在正常腦組織中不表達(dá)。實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TF抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗TF抗體、HRP標(biāo)記的親和素

5、，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TF呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶(凍干品)。3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：120ml/瓶。4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：110ml/瓶。5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：110ml/瓶。6. 生物素

6、標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1120l/瓶（1：100）7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1120l/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：110ml/瓶。 9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：120ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液（Stop Solution）：110ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀2. 高速離心機(jī)3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標(biāo)本

7、的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8C 1000 g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。最后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。標(biāo)準(zhǔn)品的

8、稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為400 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制200 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）400 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀

9、釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10l生物素標(biāo)記抗體加990l生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10l辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990l辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)

10、曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00l，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100l（取1l生物素標(biāo)記抗體加99l生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分

11、鐘，200l/每孔，甩干。 4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100l，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200l/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90l，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液

12、后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng)1. 當(dāng)混合蛋白溶液