大鼠部分胃切除對殘肝再生影響的實驗研究

1、討論大鼠部分胃切除對殘肝再生影響的實驗研究王華a，鄢業(yè)鴻b（a.江西中寰醫(yī)院普外科；b. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院移植科 南昌 330038）摘要：目的用實驗動物模型同時切除肝臟、胃，以探討部分胃切除對殘肝再生的影響。方法選用雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分成68肝葉切除組（A組：n=18），70%胃體部切除并68肝葉切除組（B組：n=18），胃竇部切除并68肝葉切除組（C組：n=18）。各組分別于術(shù)后24h，48h，72h分批處死,取肝后稱肝重，測肝再生指數(shù)，10%福爾馬林溶液固定肝臟，HE染色后測肝細(xì)胞分裂指數(shù)、免疫組化法測肝細(xì)胞PCNA（增殖細(xì)胞核蛋白抗原）指數(shù)。結(jié)果 24 h 、48 h B組術(shù)

2、后肝再生率增加較慢,與A 組相比，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；兩組72 h肝再生率差異有顯著性意義（P=0.031）。而C組術(shù)后肝再生率在不同時間點明顯偏低，和A、B組比較，差異均有非常顯著性意義（P<0.01）。B組術(shù)后24h肝細(xì)胞分裂指數(shù)、殘余肝組織 PCNA 標(biāo)記指數(shù)較低，與A組相比，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；兩組分別在48h、72h比較，差異無顯著性意義（P>0.05）。而C組術(shù)后肝細(xì)胞分裂指數(shù)、殘余肝組織 PCNA 標(biāo)記指數(shù)在不同時間明顯降低，差異均有非常顯著性意義（P<0.01）。結(jié)論 70%胃體部切除后大鼠殘肝再生延遲，胃竇部切

3、除后大鼠殘肝再生明顯受抑。關(guān)鍵詞胃切除 肝切除 胃泌素 肝再生Experimental study of the affection of partial gastrectomy on remanant hepatic regeneration in ratsWang huaa，yan ye hongb(a. Department of general Surgery ,the Zhonghuan Hospital ,jianxi b.Department of Plantation Surgery ,the First Affiliated Hospital of Nanchang Univ

4、ersity，Nanchang 330038,china）Abstract Objective: To explore the hepatic regeneration following partial hepatic resection combined with different type of gastriectomy.Methods: Fifty-four male Sprague-Dawley rats were randomized into three groups of eighteen animals each: in each group,68% of the hepa

5、tic was resected . Additionally,20% of the gastric was resected in group B with 70% of the gastric body and group C with the gastric antrum .Six rats in each group were sacrified for heptic tissue samples on the 24th ,48th , 72nd postoperative hour respectively ; residual liver was weighed ,fixed wi

6、th 10% formalin, stained with H-E. Liver regeneration rate (LRR) and MI(mitotic index) of liver were examined and PCNA (proliferating cell nuclear antigen) labeling index of hepatocyte was investigated immunohistochemically .Results: LRR increase at 24thh ,48th h in group B was obviously slower than

7、 that of group A respectively(P<0.01), difference at the values of 72nd h between them was statistically（P=0.031）.The values in group C at various time points was quite low，Compared with group A and group B ,the differences were significant (P < 0.01).The level of MI and PCNA labeling index in

8、 group B was lower than that in group A significantly (P<0.01);And there was no statistical difference at 48th h, 72nd h respectively between the two groups(P>0.05).The level of MI and PCNA labeling index in group C at various time points postoperatively was lowest compared with the other two

9、groups respectively（P<0.01）. Conclusion: The regeneration of liver is inhibited by resection of the gastric antrum combined with 68 % PH in rats, retarded in the rats by 70% of the gastric body resected combined with 68 % PH. Keywords: gastrectomy hepatectomy gastrin hepatic regeneration胃癌血行轉(zhuǎn)移主要是

10、轉(zhuǎn)移至肝臟，胃癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高，可達(dá)4451，目前肝轉(zhuǎn)移的非手術(shù)治療包括全身及局部化療的效果仍不令人滿意，因此手術(shù)切除的方法治療胃癌肝轉(zhuǎn)移仍然得到臨床關(guān)注。但是在提高肝轉(zhuǎn)移癌手術(shù)切除率的同時，不可避免要考慮肝切除后殘肝再生問題。本研究通過隨機(jī)選擇三組大鼠動物模型（胃竇部切除并68肝臟切除組、70%胃體切除并68%肝臟切除組、68肝臟切除組）來觀測分析比較各組肝再生指數(shù)、肝細(xì)胞分裂指數(shù)、及肝細(xì)胞增殖細(xì)胞核蛋白抗原(PCNA)指數(shù)。通過本實驗指導(dǎo)臨床上胃癌肝轉(zhuǎn)移時行胃癌根治術(shù)聯(lián)合肝轉(zhuǎn)移癌切除術(shù)時的肝臟切除范圍。1 材料與方法1.1 實驗動物 1.雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠5

11、4只，體重為180240g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。2環(huán)境熟悉1周，術(shù)前3天開始建立大鼠TPN模型。3. 營養(yǎng)液組成：50葡萄糖注射液，30脂肪乳劑，7復(fù)方氨基酸注射液，微量元素、維生素，每1000 ml營養(yǎng)液中各加一瓶 。按每天175 kca1kg 即 152 mlkg的標(biāo)準(zhǔn)均勻輸人營養(yǎng)液。術(shù)前3天輸入全量，術(shù)后第1天輸入標(biāo)準(zhǔn)量的13，第 2天輸 12，第 3天起輸全量。1.2 主要試劑與儀器10%中性福爾馬林固定液，大鼠Polymer kit（PV-6004）(福州邁新生物公司)，即用型二步法(非生物素)HRP檢測試劑盒(福州邁新生物公司)，彩色病理圖像分析系統(tǒng)-日本NIKON，

12、LEICA-RM 2235切片機(jī)(德國)，醫(yī)用微波爐:ID-II(上海中達(dá)醫(yī)學(xué)應(yīng)用儀器廠)，切片漂烘溫控儀(上海)，OLYMPUS-Bx60型顯微鏡(日本)。1.3 方法 A組：68肝臟切除組（n=18），單純結(jié)扎法切除68大鼠肝臟（左外葉、左中葉、右中葉）。B組：70%胃體部切除并68%肝臟切除（n=18），切除70%胃體部(約占全胃25%),再單純結(jié)扎法切除68%大鼠肝臟（左外葉、左中葉、右中葉）。C組：胃竇部切除并68肝臟切除組（n=18），切除胃竇部(約占全胃25%),再單純結(jié)扎法切除68%大鼠肝臟（左外葉、左中葉、右中葉）。術(shù)后24h，48h，72h分批處死,取肝后稱肝重，測肝再生指

13、數(shù)，并將肝標(biāo)本用10%中性福爾馬林溶液固定；HE染色后測肝細(xì)胞分裂指數(shù)、免疫組化法測肝細(xì)胞PCNA（DNA增殖抗原）。1.4觀察指標(biāo)與檢測方法：肝再生反應(yīng)活性用肝再生率、肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)及肝細(xì)胞增殖細(xì)胞核蛋白抗原(PCNA)指數(shù)進(jìn)行評估。a肝再生率按照Child公式計算確定，即（尸檢時的肝重量手術(shù)時預(yù)計的殘肝重量）/切肝的肝重量×100%。bPCNA檢測采用免疫組化PV二步法。C肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)(MI)。肝組織標(biāo)本石蠟切片行HE 染色, 由不參與實驗分組的南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科醫(yī)生在40×10倍顯微鏡視野下計數(shù)30個視野中的肝細(xì)胞數(shù)及核分裂肝細(xì)胞數(shù)，最后表示為100

14、0個肝細(xì)胞中處于有絲分裂前、中期的肝細(xì)胞數(shù), 并以百分?jǐn)?shù)表示。1.5統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用 SPSS 軟件包（11.5 版），應(yīng)用方差分析SNK-q檢驗，以 P<0.05、P<0.01 分別表示對比組之間差異具有顯著性和非常顯著性意義。2 結(jié)果 2.1 殘余肝組織再生率變化 24 h 、48 h B組術(shù)后肝再生率增加較慢,與A 組相比，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；兩組72 h肝再生率差異有顯著性意義（P=0.031）。而C組術(shù)后肝再生率在不同時間點明顯偏低，和A、B組比較，差異均有非常顯著性意義（P<0.01）。

15、表2.1 術(shù)后不同時間的肝臟再生率 （%）（n=6, x±s）組別 24h 48h 72h A 48.31±3.86 57.20±5.57 61.46±5.43 B 22.85±4.03* 47.63±5.18* 54.11±4.93 C 12.38±2.84*# 21.71±5.06*# 29.31±6.97*#注* 與A組相比：P<0.01 ，#與B組相比：P<0.01，與A組相比：P<0.052.2 肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù) A組術(shù)后肝細(xì)胞增殖明顯，24h即達(dá)高峰，而B組、C組

16、術(shù)后肝細(xì)胞增殖較緩慢，均于術(shù)后48h達(dá)高峰；B組術(shù)后24h肝細(xì)胞分裂指數(shù)較低，與A組相比，差異有非常顯著性意義（P<0.01）；兩組分別在48h、72h比較，差異無顯著性意義（P>0.05）。而C組術(shù)后肝細(xì)胞分裂指數(shù)在不同時間明顯降低，差異均有非常顯著性意義（P<0.01）。表2.2 術(shù)后不同時間的肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（%）（n=6, x±s）組別24h48h72h A 40.03±5.60 29.61±4.82 19.83±4.27 B 24.40±3.97* 31.66±2.65 22.65±2.70 C

17、 10.05±1.30*# 12.76±1.56*# 11.43±1.62*#注* 與A組相比：P<0.01 ，#與B組相比：P<0.012.3 殘余肝組織 PCNA 標(biāo)記指數(shù)變化同肝細(xì)胞有絲分裂指數(shù)變化表2.3 術(shù)后不同時間的肝臟PCNA標(biāo)記指數(shù)（%）（n=6,x±s）組別24h48h72h A 62.66±2.61 53.80±1.85 31.70±1.62 B 41.61±2.75* 55.70±2.44 33.23±1.75 C 21.46±1.34*# 38.13

18、±1.36*# 24.46±1.46*#注* 與A組相比：P<0.01 ，#與B組相比：P<0.013 討論大鼠分泌胃酸的壁細(xì)胞主要位于胃體部；胃竇部主要由G細(xì)胞及D細(xì)胞構(gòu)成，不分泌胃酸，主要分泌胃泌素及生長抑素。B組實驗保留了胃竇部，切除了約70%的胃體部，所以胃酸分泌下降。而胃泌素分泌主要受胃酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，所以胃泌素分泌會升高。近年來有研究表明2奧美拉唑可以促進(jìn)正常大鼠肝臟部分切除后肝臟的再生，對肝硬化肝切除后的肝臟亦有促進(jìn)再生作用，可使肝細(xì)胞DNA合成增加、有絲分裂指數(shù)提高、肝臟相對重量增加。這種促進(jìn)肝臟再生的機(jī)理，可能是奧美拉唑抑制了胃酸的分泌，反饋刺

19、激內(nèi)源性胃泌素增加的結(jié)果。另外，危重癥時機(jī)體對應(yīng)激反應(yīng)大量釋放應(yīng)激激素3，如促腎上腺皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素、腎上腺素等，而應(yīng)激激素的釋放又會引起胃腸肽水平的變化。研究表明，腎上腺素能促進(jìn)GAS、胰高血糖素、生長抑素的釋放，同時應(yīng)激狀態(tài)下也可引起GAs分泌增加。肝臟受損時自身迷走神經(jīng)興奮性增高刺激Gas分泌，而Gas的持續(xù)增高使幽門括約肌張力下降，十二指腸液及膽汁返流入胃，使胃竇部的pH值升高，pH值增高又刺激G細(xì)胞進(jìn)一步分泌Gas4。部分胃切除后殘胃動力下降，胃排空減緩、胃內(nèi)壓增高的物理性刺激亦促進(jìn)胃泌素的分泌。B組實驗在離斷結(jié)扎胃左血管時，不可避免地切斷了胃迷走神經(jīng)。迷走神經(jīng)對胃泌素分泌的影響

20、甚為復(fù)雜，陳劍英等5大鼠實驗結(jié)果表明胃選擇性迷走神經(jīng)切斷后血清胃泌素濃度上升了1倍。因此，理論上，70%胃體部切除后胃泌素的分泌是升高的，從而導(dǎo)致本組大鼠術(shù)后殘肝再生是促進(jìn)的。實驗結(jié)果顯示： B組與A 組相比,24 h 、48 h B組術(shù)后肝再生率有減低,差異有非常顯著性意義（P<0.01）；兩組72 h再生率差異有顯著性意義（P=0.031）。 B組術(shù)后24h肝細(xì)胞分裂指數(shù)、殘余肝組織 PCNA 標(biāo)記指數(shù)與A組相比，差異有非常顯著性意義（P<0.01），兩組分別在48h、72h比較，差異無顯著性意義（P>0.05）。結(jié)果提示，70%胃體切除后可延遲肝切除殘肝再生反應(yīng)、殘肝細(xì)

21、胞有絲分裂及殘肝細(xì)胞DNA合成。分析原因：1、該組術(shù)后24h肝細(xì)胞分裂指數(shù)、殘余肝組織 PCNA 標(biāo)記指數(shù)較低，肝再生率24 h后升高幅度才開始加快，推測70%胃體部切除的手術(shù)打擊是肝再生的抑制因素之一；2、Grider等6報導(dǎo)大鼠后胃可以分泌血管活性腸肽，它可通過AMP依賴的蛋白激酶途徑在細(xì)胞增殖、分化中起著重要的作用；通過鳥氨酸脫羧酶途徑使DNA合成加快，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。血管活性腸肽還能促進(jìn)胰島素的分泌，間接促進(jìn)肝再生。大鼠70%胃體切除后血管活性腸肽的分泌是下降的，從而削弱了這一促進(jìn)肝再生的因素。3、抑胃肽是由小腸上部的K細(xì)胞分泌，是生理性的促胰島素因子，可通過G蛋白耦聯(lián)受體增加AMP

22、，使Ca2濃度增加，從而促進(jìn)胰島素、胰高血糖素分泌進(jìn)而間接促進(jìn)肝再生7。胃酸可以通過刺激抑胃肽分泌進(jìn)而促進(jìn)胰島素分泌而間接促進(jìn)肝再生。而大鼠70%胃體切除后術(shù)后胃酸分泌是下降的，從而削弱了這一促進(jìn)肝再生的因素；4、大鼠生長素主要合成于胃,它的表達(dá)和分布在胃內(nèi)呈梯度變化,胃竇部最低。它是全面促進(jìn)機(jī)體合成代謝的關(guān)鍵激素，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡，其靶細(xì)胞主要是肝及肌細(xì)胞8。有實驗證明9,胃切除術(shù)后血漿生長素水平減少65%。所以70%胃體切除后生長素的分泌是減少的，從而也削弱了這一促進(jìn)肝再生的因素。很明顯，胃竇部切除后胃泌素的分泌是大大下降的。最近有研究表明13，在大鼠肝臟切除后的肝細(xì)胞再生中，胃泌

23、素有重要的影響。肝臟部分切除后門脈血中胃泌素濃度明顯提高，術(shù)后12h達(dá)高峰，以后逐漸回落，48h可再出現(xiàn)一個小高峰。胃泌素水平升高后，肝臟重量逐漸增加。有研究認(rèn)為10外源性胃泌素可提高血清胃泌素濃度，促進(jìn)肝臟細(xì)胞DNA的合成并增加肝臟的重量。因此，C組與A組相比，理論上不同時間點的肝再生指標(biāo)差異會有顯著性；當(dāng)然C組也不可避免的會有部分胃切除的手術(shù)打擊、生長素分泌的減少以及血管活性腸肽的減少這些不利于肝再生的因素，另外胃竇部切除后十二指腸液的返流降低了胃液的酸度，亦可能是該組肝再生受抑制的一個因素。C組與B組相比，在手術(shù)打擊方面是相近的，可比性更強(qiáng)；理論上，C組與B組術(shù)后胃泌素的分泌走勢是相反的

24、，所以不同時間點的肝再生指標(biāo)差異也會有顯著性。實驗結(jié)果顯示： C組術(shù)后肝再生率在不同時間點明顯降低,和A、B組比較，差異均有非常顯著性意義（P<0.01）。 C組術(shù)后肝細(xì)胞分裂指數(shù)、殘余肝組織 PCNA 標(biāo)記指數(shù)在不同時間點明顯降低,和A、B組比較，差異均有非常顯著性意義（P<0.01）。實驗結(jié)果與理論分析是一致的。據(jù)此推測胃泌素對肝再生是起促進(jìn)作用的，也就說明了胃竇部切除后會抑制殘肝的再生。胃泌素對肝再生的促進(jìn)作用是胃泌素的直接作用還是通過胰島素、胰高血糖素或表皮生長因子間接作用的結(jié)果還在進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1Miyazaki M, Itoh H，Nakagawa K, et al Hepatation resection of liver metastases from gastric carcinoma. AmY Gastroenterol,1997,92（3）：4904932Rasmussen TN，Jorgensen PE，