大鼠肝移植重建肝動(dòng)脈對(duì)膽管超微結(jié)構(gòu)和并發(fā)癥的影響

1、大鼠肝移植重建肝動(dòng)脈對(duì)膽管超微結(jié)構(gòu)和并發(fā)癥的影響              作者：邱明鏈 曾永毅 林科燦 張國壽 劉景豐  【摘要】  目的 觀察大鼠原位肝移植重建肝動(dòng)脈對(duì)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷后超微結(jié)構(gòu)及術(shù)后膽道并發(fā)癥的影響。方法 228只SD大鼠分為假手術(shù)組（8只）、肝移植重建肝動(dòng)脈組（55對(duì)）和未重建肝動(dòng)脈組（55對(duì)）。重建肝動(dòng)脈組和未重建肝動(dòng)脈組分別于肝臟復(fù)流后0.5、3、6、12、24、36、48 h取材，用透射電鏡觀察肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的

2、超微結(jié)構(gòu)，通過計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)線粒體形態(tài)計(jì)量分析；觀察術(shù)后膽道并發(fā)癥。結(jié)果 兩組肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞損傷均有加重，表現(xiàn)為線粒體腫脹、嵴模糊或消失、微絨毛減少等超微結(jié)構(gòu)改變，至24 h達(dá)高峰，以后逐漸恢復(fù)。術(shù)后兩組線粒體平均面積和周徑隨時(shí)間的延長逐漸增大，線粒體數(shù)密度隨時(shí)間延長而減少。在24 h，兩組缺血再灌注損傷最顯著，之后均開始緩解。在24、36、48 h，兩組線粒體平均面積、平均周徑比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.566，-7.780，-4.730，-4.610，-2.599，-5.370，P0.05）；在36、48 h，兩組線粒體平均數(shù)密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.619，4

3、.000，P0.05）。重建肝動(dòng)脈組的膽道并發(fā)癥發(fā)生率低于未重建肝動(dòng)脈組（2=4.286，P0.05）。結(jié)論 大鼠肝移植重建肝動(dòng)脈對(duì)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷后的超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，有利于術(shù)后恢復(fù)和減少膽道并發(fā)癥的發(fā)生。 【關(guān)鍵詞】  肝移植； 肝動(dòng)脈重建； 膽道并發(fā)癥； 大鼠； 超微結(jié)構(gòu)Effects of hepatic artery reconstruction in rat with orthotopic liver transplantation on ultrastructure of intrahepatic biliary epithelial cells an

4、d biliary complications    【Abstract】  Objective  To observe the effects of hepatic artery reconstruction in rat with orthotopic liver transplantation （OLT） on ultrastructure changes of intrahepatic biliary epithelial cells after ischemia reperfusion injury and postoperative

5、 biliary complications. Methods  Male SD rats were divided into sham operation group（SO）, OLT with hepatic artery reconstruction group （HA） and OLT without hepatic artery reconstruction group （NA）. The liver tissue samples were collected at 0.5, 3, 6, 12, 24, 36, 48 hours after ischemia reperfu

6、sion in both HA group and NA group. The ultrastructure of intrahepatic biliary epithelial cells was observed by transmission electron microscope, and the morphometric analysis by the computer image analysis system. The postoperative biliary complications were also observed. Results  In HA group

7、 and NA group, the injury of intrahepatic biliary epithelial cells aggravated gradually along with the reperfusion. The ultrastructure changes, such as enlarged mitochondria, blurred or disappeared cristae and decreased number of microvilli, were most significant at 24 hours and then recovered gradu

8、ally. The mitochondrial average area and average perimeter were increased and the mitochondrial numerical density was decreased gradually along with the reperfusion. At 24, 36, 48 hours, the mitochondrial average area and average perimeter in NA group were significantly greater than those in HA grou

9、p （t=-3.566, -7.780, -4.730, -4.610, -2.599, -5.730, P0.05）. The average numerial density of mitochondia in NA group was significantly less than that in HA group at 36, 48 hours（t=-4.619, 4.000, P0.05）. The incidence rate of biliary complications in HA group is significantly lower than that in NA gr

10、oup （2=4.286, P0.05）. Conclusions  Hepatic artery reconstruction in rat with OLT has an protective effect on the ultrastructure of intrahepatic biliary epithelial cells after ischemia reperfusion. It is beneficial to the recovery of intrahepatic bile duct epithelial cells and can reduce the inc

11、idence rate of biliary complications.   【Key words】  Liver transplantation;  Hepatic artery reconstruction;  Biliary complication;  Rat;Ultrastructure   大鼠肝移植是肝移植基礎(chǔ)研究的常用模型。由于大鼠肝動(dòng)脈血流量較少，未重建肝動(dòng)脈并不影響大鼠肝移植術(shù)后生存率。因此，在該模型中是否重建肝動(dòng)脈一直存在爭論。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷的變化進(jìn)行電鏡超微

12、結(jié)構(gòu)定量分析，探討大鼠肝移植重建肝動(dòng)脈對(duì)術(shù)后肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷及膽道并發(fā)癥的影響。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)分組及肝移植模型的建立   雄性SD大鼠228只，體質(zhì)量240260 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分為假手術(shù)組（8只）、肝移植重建肝動(dòng)脈組（55對(duì)）和未重建肝動(dòng)脈組（55對(duì)）。其中重建肝動(dòng)脈組和未重建肝動(dòng)脈組又根據(jù)肝臟再灌注后0.5、3、6、12、24、36、48 h分為7小組，每小組5只。兩組各留20只觀察術(shù)后膽道并發(fā)癥。未重建肝動(dòng)脈組按改良“二袖套”法建立大鼠肝移植模型1-2。重建肝動(dòng)脈組則在未重建肝動(dòng)脈的基礎(chǔ)上，保留供

13、肝的肝固有動(dòng)脈、肝總動(dòng)脈及腹腔干，分別結(jié)扎、遠(yuǎn)端離斷脾動(dòng)脈和胃左動(dòng)脈；修肝時(shí)于腹腔干置一自制內(nèi)支架并結(jié)扎固定；植肝時(shí)結(jié)扎受體左腎動(dòng)脈遠(yuǎn)端，近端動(dòng)脈夾暫時(shí)鉗夾阻斷血流，將受體腹腔干近腹主動(dòng)脈處剪一楔形小口，置入位于供肝腹腔上的內(nèi)支架，結(jié)扎固定，移去動(dòng)脈夾，開放血流，即完成重建肝動(dòng)脈的肝移植模型。未重建肝動(dòng)脈組供體手術(shù)時(shí)間為（19.6±2.4）min，無肝期時(shí)間為（17.5±2.5）min；重建肝動(dòng)脈組供體手術(shù)時(shí)間為（21.3±2.9）min，無肝期時(shí)間為（17.9±2.3）min， 肝動(dòng)脈重建時(shí)間為（4.2±1.7）min。兩組熱缺血和冷缺血時(shí)間

14、分別控制在5 min和60 min。假手術(shù)組只開腹游離肝周韌帶后取標(biāo)本。1.2  術(shù)后標(biāo)本的處理和膽道并發(fā)癥的觀察   兩組分別于術(shù)后0.5、3、6、12、24、36、48 h取材。重建肝動(dòng)脈組先觀察肝動(dòng)脈重建處及供肝肝固有動(dòng)脈的搏動(dòng)及充血情況，搏動(dòng)、充血均良好者，予以取材，否則剔除。標(biāo)本用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精-丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋；超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，在飛利浦208型透射電鏡下觀察肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞并采集圖像，每張切片選出5個(gè)肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，描出其內(nèi)所有線粒體，計(jì)算肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞

15、線粒體平均面積、平均周徑和數(shù)密度。術(shù)后30 d解剖未死亡的大鼠，觀察是否存在膽漏、肝外膽管梗阻、肝內(nèi)小膽管阻塞（肝葉片狀黃染）等并發(fā)癥及重建肝動(dòng)脈組動(dòng)脈的通暢情況。1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析   膽管上皮細(xì)胞線粒體平均面積、平均周徑和數(shù)密度的數(shù)據(jù)采用x±s表示，不同組間均數(shù)的比較采用方差分析。膽道并發(fā)癥發(fā)生率采用2檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。         2  結(jié)果2.1  肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 

16、  假手術(shù)組膽管上皮細(xì)胞呈柱狀，細(xì)胞核位于基底部，膜層結(jié)構(gòu)完整，線粒體不腫脹，嵴清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴(kuò)張，核糖體排列整齊，微絨毛豐富。重建肝動(dòng)脈組和未重建肝動(dòng)脈組在術(shù)后均見線粒體腫脹，嵴模糊，微絨毛減少，并隨時(shí)間延長而加重。在24 h損傷最重，線粒體顯著腫脹，嵴消失，基質(zhì)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，微絨毛消失。48 h兩組均有恢復(fù)，但未重建肝動(dòng)脈組恢復(fù)緩慢（圖1），重建肝動(dòng)脈組恢復(fù)較明顯（圖2）。2.2  肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)計(jì)量分析   在重建肝動(dòng)脈組和未重建肝動(dòng)脈組中，線粒體平均面積及平均周徑均隨著術(shù)后時(shí)間的延長逐漸增大，而線粒體數(shù)密度則隨著術(shù)后時(shí)間的延長逐

17、漸減少。缺血再灌注損傷0.53 h數(shù)值變化急劇，以后趨于緩慢；在24 h損傷最顯著，之后開始緩解。兩組的線粒體平均面積在24、36、48 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.566，-7.780，-4.730，P0.05）；兩組的線粒體平均周徑在24、36、48 h比較， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.610，-2.599，-5.370，P0.05）； 兩組的線粒體平均數(shù)密度在36、48 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.619，4.000，P0.05）。2.3  術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生率   重建肝動(dòng)脈組術(shù)后死亡2只，1個(gè)月生存率為90%（18/20）；有2

18、只血栓形成，通暢率為89%（16/18）；3只出現(xiàn)肝葉小片狀黃染（肝內(nèi)小膽管阻塞所致），膽道并發(fā)癥發(fā)生率為15%（3/20）。未重建肝動(dòng)脈組術(shù)后死亡3只，其中有2只分別死于膽漏和膽總管梗阻，1個(gè)月生存率為85%（17/20）；7只出現(xiàn)肝葉片狀黃染甚至累及整個(gè)肝葉，膽道并發(fā)癥發(fā)生率為45%（9/20）。兩組膽道并發(fā)癥發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=4.286，P0.05）。3  討論3.1  膽道的動(dòng)脈血供及其缺血再灌注損傷程度指標(biāo)   膽道系統(tǒng)由肝動(dòng)脈分支在膽管周圍形成血管網(wǎng)供血。因此，建立肝動(dòng)脈血液供應(yīng)對(duì)于防止大鼠肝移植術(shù)后膽管缺血、減少膽道并發(fā)癥的發(fā)生有著十分重要的意義。肝臟缺血再灌注損傷的病理過程是一個(gè)連續(xù)的過程，分兩個(gè)階段：早期階段約在再灌注后的02 h，晚期階段約在再灌注后的648 h，損傷程度與缺血時(shí)間有關(guān)3。本研究中數(shù)密度代表線粒體的分布密度；分析線粒體平均面積和平均周徑可反映線粒體腫脹程度，可以說明線粒體受損的狀況，能較客觀地反映膽管上皮細(xì)胞缺血再灌注損傷的程度。3.2  重建肝動(dòng)脈對(duì)大鼠肝移植術(shù)后膽道的影響   本實(shí)驗(yàn)結(jié)果