周圍神經再生研究方法的進展

1、周圍神經再生研究方法的進展 10-05-06 08:57:00 作者：趙維彥編輯：studa20【關鍵詞】 周圍神經損傷 1 常規(guī)周圍神經再生檢測方法及現(xiàn)今發(fā)展的方向 神經行為學及神經電生理學。這兩種檢查方法簡單方便，也是臨床上常用的檢測神經再生的方法，但均是反應神經功能的間接指標，所以出現(xiàn)陽性結果時間較晚，不能很好地及時地反應神經真正的再生情況1、8。 現(xiàn)今研究神經再生的動物實驗常用組織形態(tài)學的檢查及利用示蹤劑進行軸突的示蹤，從而能直接地觀察到神經形態(tài)上變化，了解神經軸突的生長情況，判定神經的再生程度。神經再生從微觀來看，組織結構上為軸突的再生，功能上為軸漿流運輸?shù)幕謴?，運送神經遞質到靶器官

2、；大體來講，神經再生在結構上為神經纖維連續(xù)性的恢復，外形光滑完整，功能上為運動及感覺的恢復。 2 傳統(tǒng)的組織形態(tài)學研究周圍神經再生 周圍神經組織形態(tài)學研究的基礎是神經的解剖結構。從解剖學上講神經系統(tǒng)的基本結構是神經元和神經膠質。神經元由胞體和突起兩部分構成，神經元較長的突起和其外表包被的結構稱為神經纖維。較大的神經元軸突常被附近的神經膠質或雪旺氏細胞卷繞包裹形成髓鞘，可保證軸突能高速傳導生物電信號。解剖上神經元有長短不等的軸突，軸突由軸索及表面的髓鞘構成。軸突的外面由神經內膜覆蓋。軸索、髓鞘、神經內膜組成了完整的神經纖維，多個神經纖維組合在一起形成神經束，表面包繞神經束膜。多條神經束形成神經干

3、，表面是神經外膜。組織形態(tài)學檢查是對神經再生結構恢復的研究。研究神經再生形態(tài)學傳統(tǒng)的方法是對再生的神經組織結構直接染色成像。包括HE染色，乙酰膽堿酯酶染色，免疫組化染色(抗神經絲單克隆抗體進行標記，然后呈色反應)，甲苯胺藍染色等。采用HE染色(蘇木精-伊紅)染色方法，直接觀察再生神經的有髓纖維(軸突)的數(shù)目；乙酰膽堿酯酶染色，可以區(qū)分運動及感覺神經纖維軸突數(shù)；抗神經絲單克隆抗體進行標記，然后呈色反應、免疫組化染色，直接觀察再生的神經纖維10。傳統(tǒng)的方法是對再生神經組織結構的靜態(tài)研究，可以通過染色直接觀察再生的神經纖維及軸突的形態(tài)及數(shù)目8，1719。 3 通過神經示蹤劑進行軸突示蹤研究周圍神經的

4、再生 研究神經再生的基礎是神經軸漿流的運輸。神經元產生的營養(yǎng)物質運輸至軸突及其分支以維持其代謝，在神經末梢釋放的神經肽及合成經典遞質的酶也需在胞體合成；從末梢也有影響細胞代謝的物質逆向轉運至胞體，這種運輸現(xiàn)象稱為軸漿(突)運輸。軸突運輸是反映神經結構、功能和代謝完整性的重要指標。周圍神經損傷段軸漿流運輸?shù)幕謴褪巧窠浽偕淖畛踝C據(jù)8。 目前動物實驗中應用最廣泛的研究神經再生的方法是利用神經元軸漿運輸現(xiàn)象的示蹤法，也就是動態(tài)研究神經再生的情況。神經示蹤劑通過順行及逆行運輸用來研究軸突的傳導路徑，研究神經元之間的纖維聯(lián)系及神經再生的情況。 現(xiàn)有的研究再生神經軸突運輸，神經形態(tài)學的檢測方法歸納如下。

5、3.1 辣根過氧化物酶示蹤技術(HRP示蹤) HRP被神經組織攝入后，順向或逆向運輸，然后用組織化學方法顯示HRP的運輸結果為HRP示蹤。 辣根過氧化物酶能被神經末梢攝取，經周圍神經的軸突運輸，并參與神經細胞的代謝。HRP注入肌肉被神經末梢攝取后，經軸漿逆流可以通過神經縫合口到達神經近段；HRP也可以被胞體攝入并順向送至終末部。常規(guī)的HRP示蹤為聯(lián)苯胺法或TMB法。將HRP注射到神經的一定部位，經過固定及切片，用聯(lián)苯胺法顯示標記的結果。由于HRP參與細胞代謝，所以缺點是在細胞內存留的時間短15，20。 3.2 放射性核素示蹤(放射性核素標記氨基酸或HRP) (1)實驗選用發(fā)射射線的125I為標

6、記物，標記酪氨酸 酪氨酸參與神經細胞的營養(yǎng)代謝，將標記的酪氨酸直接注入神經干內，標本以-計數(shù)器進行測量，方法簡便，為將來臨床應用131I進行檢測提供了實驗基礎。實驗結果顯示，在大鼠坐骨神經干內注射125I-酪氨酸，隨著軸漿流的運輸通過神經吻合口。放射性核素標記的氨基酸是軸漿流體內檢測實驗研究較好的實驗模型。具有標記方法簡便、可靠，注射方法簡單，吸收時間和轉運速率均適中的優(yōu)點1。 (2)HRP方法與放射性示蹤劑(125I)聯(lián)合應用。125IHRP注入肌肉被神經末梢攝取后，經軸漿逆流可以通過神經縫合口到達神經近段，應用-計數(shù)器可探測神經組織中的125碘放射性強度。研究125碘-辣根過氧化物酶(12

7、5I-HRP)追蹤術后神經軸漿流的可行性，為臨床應用放射性同位素研究神經再生提供實驗依據(jù)。實驗中，將125I-HRP注入大鼠小腿三頭肌后，切取其坐骨神經組織進行放射性強度的r計數(shù)，能判斷神經再生的程度3。 實際上，隨著同位素標記技術的提高和同位素檢測設備的改善，對微量放射性已能檢測，進行同位素標記物質隨軸漿流轉運的體內檢測也已有可能，并有可能成為臨床上檢測神經再生的重要手段。 3.3 順行示蹤技術(生物素葡聚糖胺BDA、病毒追蹤法) BDA追蹤法的優(yōu)點：能長距離運輸，可雙向運輸，因而局部注射后有利于觀察結果。在中樞神經系統(tǒng)的解剖學研究中，BDA染色能非常清晰地顯示軸突，反應程序簡單，靈敏度高。BDA染色后，可與熒光追蹤劑聯(lián)合使用，便于在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察。BDA與卵白素(阿維丁，avidin)之間有特別強的親和力，常用結合過氧化物酶或熒光素的avidin與之孵育結合，通過組化反應或熒光顯微鏡觀察標記結果。葡聚糖用于順行追蹤時能充分顯示軸突及其分支8。 通過大鼠的實驗研究，10BDA可清晰地在周圍神經軸突內顯像，操作簡單，結果易于觀察。BDA神經干局部注射后能較清楚而直觀地顯示局部軸突運輸?shù)那闆r。BDA注射點：經DAB顯色見標記陽性的神經纖維呈褐紫色標記，有髓神經纖維較粗。共聚焦顯微鏡觀察，BDA注射點見髓鞘熒光信號較強，髓鞘被均勻染色，高倍鏡