混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平與移植腎急性排斥反應(yīng)的聯(lián)系

1、    混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子 水平與移植腎急性排斥反應(yīng)的聯(lián)系        摘要目的：探討混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC）上清液中細(xì)胞因子水平與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的關(guān)系，評(píng)價(jià)腎移植術(shù)前檢測MLC上清液中細(xì)胞因子水平，作為預(yù)測急性排斥反應(yīng)指標(biāo)的臨床價(jià)值。方法：選取48例接受同種異體腎移植術(shù)的患者為檢測對(duì)象。在手術(shù)當(dāng)日，分離其外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）與供者單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)（反應(yīng)組），同時(shí)以受者單純自身PBMC進(jìn)行培養(yǎng)（對(duì)照組）。在培養(yǎng)第1、3、5天測

2、MLC上清中IL-2和TNF-水平，并觀察其分泌動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果：發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者，在3次時(shí)間點(diǎn)上，兩種細(xì)胞因子水平均高于腎功能穩(wěn)定組，差異顯著。在發(fā)生急性排斥反應(yīng)和腎功能穩(wěn)定的兩組受者中，反應(yīng)組較對(duì)照組細(xì)胞因子水平都有增加；急排的患者增加量高于腎功穩(wěn)定的受者，差異顯著。排斥組與腎功能穩(wěn)定組兩種細(xì)胞因子的分泌規(guī)律基本一致，但排斥組峰值都高于腎功能穩(wěn)定組。結(jié)論：檢測MLC上清液中細(xì)胞因子水平可以作為合理選擇供受者、預(yù)測急性排斥反應(yīng)的方法。關(guān)鍵詞混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞因子急性排斥 ALTERATION OF CYTOKINES IN MLC SUPERNATANTS IN PATIENTS WI

3、TH ACUTE RENAL ALLOGRAFT REJECTIONLIU Li，ZHANG Yuhai（Department of Urology，Beijing Friendship Hospital，Beijing 100050）OBJECTIVE To explore the relationship between cytokines in MLC supernatants and acute rejection in renal allograft recipients and to evaluate the clinical value of cytokines determin

4、ation in MLC  donor selection METHODOLOGY 34 male and 14 female randomly chosen renal allograft recipients were involved in this studyPBMC was separated routinely in donors and recipientsFor one-way MLC，stimulator PBMC was treated with mitomycin CCell concentration was 1.5×106mlResponder P

5、BMC （recipients?PBMC） was co-cultured with either mitomycin C treated autologous PBMC （control cultures） or mitomycine C treated allogenic（stimulated cultures）in duplicates of fourELISA was used for the determination of IL-2 and TNF-Samples were collected and measured on day1，3，and 5 RESULTS In 20 p

6、atients who suffered acute rejection （RG group），the levels of both cytokines in control and stimulated cultures were significantly higher thanthose of the 28 patients whose renal function was stable（SG group）Either in RG or SG on day 1，3，and 5，both cytokines?levels in stimulated cultures were higher

7、 than in control culturesCytokines? gaps between stimulated and control cultrues were significantly higher in RG than in SGThe kinetics of IL-2 and TNF- in rejection group was similar to stable group CONCLUSION The increased levels of both IL-2 and TNF- in MLC supernatant are of significance in pred

8、icting the occurrence of acute rejection in renal allograft recipientsAnd they may also be applied in the selection of compatible related and unrelated donorsKey words lymphocyte culture test cytokine acute renal rejection影響腎移植成敗的因素很多，術(shù)后的免疫性排斥反應(yīng)是移植腎失功的最主要原因1。細(xì)胞因子，特別是IL-2、TNF-在移植免疫中發(fā)揮重要作用24。近年來，通過各種方

9、法測定細(xì)胞因子，可作為診斷急性排斥反應(yīng)和反應(yīng)強(qiáng)度的方法2，5，6。血IL-2和sIL-2R、IL-6、TNF-水平都已用于臨床，被作為監(jiān)測排斥反應(yīng)的指標(biāo)。值得強(qiáng)調(diào)的是這些結(jié)論都依據(jù)腎移植術(shù)后血清標(biāo)本的檢測結(jié)果。而發(fā)生感染，特別是巨細(xì)胞病毒感染時(shí)，血清中炎性介質(zhì)水平也會(huì)增高。環(huán)孢素A（CsA）等免疫抑制劑可引起某些細(xì)胞因子水平降低，而抗CD3單抗等治療早期可激活體內(nèi)T細(xì)胞，繼而導(dǎo)致血清IL-2、TNF-水平升高，給鑒別診斷帶來一定困難7。作為體外研究排斥反應(yīng)的重要模式混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC）可以避免感染、用藥及其它諸多因素導(dǎo)致的細(xì)胞因子水平的變化。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖沁M(jìn)一步研究MLC上清液中IL-2和

10、TNF-的產(chǎn)生及其與排斥反應(yīng)的關(guān)系。評(píng)估檢測MLC上清液中細(xì)胞因子水平作為預(yù)測排斥反應(yīng)及合理選擇受者方法的可行性。1對(duì)象和方法11檢測對(duì)象隨機(jī)選取48例接受同種異體腎臟移植患者，男性34例，女性14例，平均年齡39.6（1864）歲。術(shù)前供受者ABO血型相容，淋巴細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)平均為1.7（1.05.0），HLA-A、B、Dr配型至少有一個(gè)位點(diǎn)相配。術(shù)后均采用CsA硫唑嘌呤強(qiáng)的松的三聯(lián)免疫抑制治療。12診斷標(biāo)準(zhǔn)121腎功良好腎移植術(shù)后腎功能恢復(fù)良好且穩(wěn)定；無繼發(fā)感染；無急性排斥反應(yīng)；無CsA中毒。122急性排斥反應(yīng)臨床有發(fā)熱、少尿、雙膝關(guān)節(jié)疼痛和移植腎區(qū)脹痛等癥狀。體檢：血壓升高、移植腎腫大、質(zhì)

11、硬、壓痛等。實(shí)驗(yàn)室檢查：BUN和SCr升高、尿脫落細(xì)胞中有大量淋巴細(xì)胞（5個(gè)HP）、CsA濃度偏低；無繼發(fā)感染和CsA中毒現(xiàn)象?？古懦庵委熡行?。移植腎穿刺或切除病理標(biāo)本符合急性排斥反應(yīng)病理改變。13實(shí)驗(yàn)方法131細(xì)胞制備腎移植手術(shù)當(dāng)日取健康供者和受者無菌抗凝血10ml，常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×109L。刺激細(xì)胞：供者或受者自身PBMC與絲裂霉素按91（VV）比例混合，在37孵育箱內(nèi)處理30min，洗滌3次，備用。反應(yīng)細(xì)胞：未經(jīng)絲裂霉素處理的受者PBMC，細(xì)胞濃度為1.5×109L。132混合白細(xì)胞培養(yǎng)（MLC）取反應(yīng)細(xì)胞與刺激細(xì)胞置于96

12、孔培養(yǎng)板，每孔兩種細(xì)胞各100l。設(shè)刺激細(xì)胞是受者自身PBMC孔為對(duì)照孔（組），刺激細(xì)胞是供者PBMC孔為反應(yīng)孔（組）。每份標(biāo)本設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板放入5CO2、37條件下培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液系含10（VV）滅活小牛血清及RPIM1640培養(yǎng)液。133細(xì)胞因子測定在MLC第1、3、5天分別收集培養(yǎng)液上清置80冰箱保存待檢。人IL-2、TNF-均采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定。試劑盒由深圳晶美生物制品公司提供，按使用說明書操作。14統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組計(jì)量資料采用方差分析，兩組計(jì)量資料采用兩均數(shù)t檢驗(yàn)，多組計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。P0.05為差異顯著，P

13、0.01為差異非常顯著。以上數(shù)據(jù)均由國際通用數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS7.5版完成。2結(jié)果在48例接受腎移植手術(shù)的患者中，術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)20例，為急性排斥組。其中男性14例，女性6例，平均年齡41.0(1964)歲。術(shù)后移植腎功能保持穩(wěn)定的28例，為腎功能穩(wěn)定組。其中男性20例，女性8例，平均年齡38.6（1858）歲。兩組受者在性別、年齡、ABO血型、淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)及供腎等臨床特征方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢查均無顯著差異（見表1）。21急性排斥組與腎功能穩(wěn)定組術(shù)前MLC上清液中IL-2水平的比較見表2。從表中數(shù)值看，無論在哪一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者，其反應(yīng)組IL-2的水平均高于腎功能穩(wěn)定組中

14、反應(yīng)組IL-2水平。除第1天外，在第3天和第5天，這種差異達(dá)到了顯著水平（P0.05）。兩對(duì)照組之間相比，差異不顯著。在所有時(shí)間點(diǎn)上，排斥與穩(wěn)定兩組的反應(yīng)組IL-2水平均高于對(duì)照組IL-2水平，差異顯著（P0.05）。Table1Clinicaldataofpatientsintherejectiongroupandthestablegrouprejectiongroupstablegrouppatientnumber2028malefemale146208meanage（range）41.0±13.6(1964)38.6±10.9(1858)ABOgroups（ABABO

15、）46465959HLAmatchesoneormorematchesoneormorematchesMLC（1；2；3；4；5）10；8；1；1016；7；3；1；1MLC：mixedlymphocytecytotoxicity 22急性排斥組與腎功能穩(wěn)定組術(shù)前MLC上清液中TNF-水平比較見表3。Table2SupernatantsIL-2intherejectiongroupandthestablegroup（ngL，±s）rejectiongroupstablegroupcontrolpanelreactionpanelcontrolpanelreactionpanelIL-

16、2at1stday19.2±730*331±850154±990*302±125IL-2at3rdday274±159*741±253204±109*376±114IL-2at5thday199±690*406±136120±630*241±980Forcontrolpanel，mitogenstimulatedPBMCisofrecipientsoriginAndforreactionpanel，mitogenstimulatedPBMCisofdonorsorigin*：

17、comparisonbetweencontrolpanelandreactionpanelwithineachgroup，P0.05：comparisonbetweenreactionpanelsofeachgroup，P0.05 Table3SupernatantsTNF-intherejectiongroupandthestablegroup（ngL，±s）rejectiongroupstablegroupcontrolpanelreactionpanelcontrolpanelreactionpanelIL-at1stday1235±170*3083±462

18、1314±472*2158±836IL-at3rdday477±160*964±169434±180*717±248IL-at5thday672±138*1205±291196±670*351±570Forcontrolpanel，mitogenstimulatedPBMCisofrecipientsoriginAndforreactionpanel，mitogenstimulatedPBMCisofdonorsorigin*：comparisonbetweencontrolpanelandre

19、actionpanelwithineachgroup，P0.05：comparisonbetweenreactionpanelsofeachgroup，P0.05 從數(shù)據(jù)上看，排斥組與腎功能穩(wěn)定組兩組的反應(yīng)組之間差異顯著（P0.05），前者均數(shù)高于后者。每組組內(nèi)反應(yīng)組TNF-水平均高于對(duì)照組水平。差異顯著（P0.05）。兩對(duì)照組間比較，差異不顯著。23兩組患者中，反應(yīng)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞因子分泌水平增加量的比較見表4。Table4TheincrementofIL-2andTNF-productionintherejectiongroupandstablegroup（ngL，±s）in

20、crementofIL-2incrementofTNF- RG SG RG SG1stday13.90±690151±1031823±409*844±5613rdday467±252*172±860487±430*284±1335thday207±163*121±690533±270*155±370*：comparisonbetweenRGandSG，P0.05*：comparisonbetweenRGandSG，P0.01 在三次時(shí)間點(diǎn)上反應(yīng)組細(xì)胞因子水平均高于對(duì)照組，但增

21、加的程度卻不同，急性排斥組高于腎功能穩(wěn)定組（僅第1天IL-2增加量除外）。差異顯著或非常顯著（P0.05或P0.01）。24IL-2的分泌動(dòng)態(tài)根據(jù)細(xì)胞因子檢測結(jié)果，按每一時(shí)間點(diǎn)上4次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值繪。從1中可見MLC后第1天上清液中即可測到IL-2。第3天分泌量達(dá)到高峰，然后下降，至第5天時(shí)基本恢復(fù)到第1天水平。發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者和腎功穩(wěn)定患者的培養(yǎng)上清液中IL-2的變化較為一致，所區(qū)別的是，排斥組的各點(diǎn)值高于穩(wěn)定組（見1）。Fig1DynamicchangesofIL-2 productionFig2DynamicchangesofTNF-production25TNF-分泌動(dòng)態(tài)兩組患者

22、中，其對(duì)照組與反應(yīng)組之間，細(xì)胞因子水平變化的規(guī)律一致，在排斥組，MLC后第1天即達(dá)到峰值，第3天較第1天TNF-水平下降，至第5天又有回升。穩(wěn)定組第1天達(dá)到峰值，其后逐漸降低，至第5天達(dá)最低值（見2）。3討論腎移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)涉及細(xì)胞免疫和體液免疫介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。無論是細(xì)胞免疫還是體液免疫都離不開細(xì)胞因子在其中發(fā)揮作用。與移植免疫相關(guān)的細(xì)胞因子種類很多，其中包括TNF-和IL-2。近年來不斷有利用檢測細(xì)胞因子作為術(shù)后監(jiān)測急性排斥反應(yīng)指標(biāo)的研究，并取得了較為肯定的結(jié)果2，5，6。為了排除腎移植術(shù)后免疫抑制劑的應(yīng)用及感染，特別是巨細(xì)胞病毒感染等因素對(duì)細(xì)胞因子水平的影響，我們選擇了MLC作為檢

23、測手段。MLC是移植排斥反應(yīng)中機(jī)體對(duì)抗原識(shí)別的一種重要的體外模式。在此反應(yīng)中，淋巴細(xì)胞的增生及某些細(xì)胞因子的釋放，在一定程度上可預(yù)示體內(nèi)的排斥反應(yīng)發(fā)生與否8。另外，MLC無需在移植物植入體內(nèi)就可以實(shí)施，在時(shí)序上有了前瞻性的特點(diǎn)，而不僅僅局限于術(shù)后監(jiān)測。在本實(shí)驗(yàn)中，我們在移植術(shù)前的MLC后第1天、第3天和第5天分別檢測了MLC上清液中兩種細(xì)胞因子（IL-2、TNF-)的水平。凡是發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者，其MLC中反應(yīng)組的細(xì)胞因子水平，明顯高于腎功能穩(wěn)定組中反應(yīng)組的水平，而且差異顯著（P0.05）（僅第1天IL-2除外）。這說明兩個(gè)反應(yīng)組相比，發(fā)生排斥反應(yīng)的MLC中，兩種混合培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳背景差異

24、較大，即MHC-類抗原的匹配程度低于腎功能穩(wěn)定組。對(duì)照組與反應(yīng)組的區(qū)別在于對(duì)照組中刺激細(xì)胞是經(jīng)過絲裂霉素處理的受者自身PBMC，而非供者PBMC。故在理論上不難理解對(duì)照組細(xì)胞因子水平應(yīng)該低于反應(yīng)組。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了無論發(fā)生急性排斥反應(yīng)與否，在三次時(shí)間點(diǎn)上三種細(xì)胞因子的水平反應(yīng)組明顯高于對(duì)照組，差異顯著。兩對(duì)照組相比，都是自身混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（AMLR），彼此之間并無顯著差異。為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更具有可比性，我們計(jì)算了細(xì)胞因子分泌增加量。即MLC與AMLR上清中細(xì)胞因子水平的差值（反應(yīng)組-對(duì)照組）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者其細(xì)胞因子增加量超過了腎功能穩(wěn)定組，差異達(dá)到顯著或非常顯著（P

25、0.05或P0.01）。再次說明了急排組供受者間MLC-類抗原匹配程度不如腎功能穩(wěn)定組供受者，即供受者遺傳背景差異更大。就細(xì)胞因子的分泌動(dòng)態(tài)而言，四種組別中，IL-2的分泌規(guī)律較為一致。均在第2天出現(xiàn)峰值，且排斥組各點(diǎn)值均高于相應(yīng)的穩(wěn)定組各點(diǎn)值。TNF-的峰值出現(xiàn)在第1天，其后漸降，急性排斥組中第五天的TNF-較第3天略有回升，但差別不大。本實(shí)驗(yàn)中患者術(shù)后出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的時(shí)間平均在術(shù)后第12天。而細(xì)胞因子分泌的峰值、時(shí)序變化是MLC后第1、3、5天，即術(shù)后的第1、3、5天。比排斥反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間早近一周，滿足了時(shí)序上預(yù)測評(píng)估排斥反應(yīng)出現(xiàn)的要求。淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)、HLA分型無顯著差異的患者，腎移植

26、術(shù)后預(yù)后不同。其中的原因錯(cuò)綜復(fù)雜。術(shù)前多次輸血、妊娠、二次移植等多種因素導(dǎo)致的機(jī)體免疫系統(tǒng)處于不同狀態(tài)是不容忽視的重要因素。完全可以在移植術(shù)前，利用檢測供受者細(xì)胞間特異性MLC上清液中的細(xì)胞因子水平的方法，對(duì)最適相容性相關(guān)和不相關(guān)的供受者做出篩選。凡淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率高，上清液中細(xì)胞因子水平較高的個(gè)體可暫緩腎移植術(shù)。已手術(shù)的患者可列為“高危人群”，一旦術(shù)后表現(xiàn)出相應(yīng)臨床征兆，結(jié)合其它檢查結(jié)果，優(yōu)先考慮急性排斥的診斷。MLC上清液中細(xì)胞因子水平的變化，還啟發(fā)人們利用抗細(xì)胞因子抗體逆轉(zhuǎn)排斥反應(yīng)的發(fā)生。這在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭腥〉昧顺晒?。提供了又一治療思路。綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為：檢測MLC上清液中TNF-和IL-2水平，可以作為腎移植術(shù)后預(yù)測急性排斥反應(yīng)出現(xiàn)的一項(xiàng)指標(biāo)：結(jié)合患者臨床表現(xiàn)，配合其它檢查方法，它在監(jiān)測急性排斥反應(yīng)方面有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。檢測MLC中TNF-和IL-2的水平，可以