急性心肌缺血再灌注時Bax的免疫組織化學(xué)研究

1、急性心肌缺血再灌注時Bax的免疫組織化學(xué)研究        【摘要】 目的 為心肌缺血再灌注損傷所致心性猝死的法醫(yī)學(xué)診斷提供形態(tài)學(xué)依據(jù)，方法運用免疫組織化學(xué)方法，研究bax蛋白在心肌組織中不同區(qū)域的表達。 結(jié)果 對照組正常心肌組織無bax蛋白表達。bax蛋白再灌注05h后即可在缺血區(qū)域表達，且表達主要在心肌內(nèi)層。再灌注1 h后可觀察到bax蛋白不僅表達于心肌內(nèi)層且已經(jīng)擴展至心肌的全層。再灌注2 h發(fā)現(xiàn)心肌外層表達明顯強于心肌內(nèi)層，隨著再灌注時間的延長可以發(fā)現(xiàn)bax蛋白的表達逐漸減弱。 結(jié)論在急性心肌缺血再灌注中，b

2、ax基因?qū)π募〖毎蛲龅陌l(fā)生有著重要的作用，且可以作為心肌缺血再灌注的早期診斷提供一項輔助診斷依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】心肌再灌注損傷；bax蛋白；免疫組織化學(xué)；法醫(yī)病理學(xué)【中圖分類號】d9191；r3923【文獻標識碼】a【文章編號】 10079297(2004)02012902immunohistoc hemical study on bax protein expression in the acute myocardial ischemiareperfusion in ratsw ang feng，wang de-guo，flu yong-liang，li yong-hongdepartment

3、 of forensic pathology，wannan medical college，anhui 241001，china【abstract】0bjective to search the objective morphologic evidence for the forensic pathological diagnosis on the acutemyocardial ischemiareperfusion in rats method to study the expression of bax protein in the different rid& in the a

4、cutemyocardial ischemiareperfusion(ir)in rats with immunohistochemistry result these was no expression of bax proteinin control groupthe expression of bax protein began to increase in myoc ytes 05 h after ir in the ischemic areas and the expression of bax protein in inner layer was stronger than in

5、outer layerhowever，the expression of bax protein appeared firstlyin the inner layer of myocardium and extended gradually toward the outer layer 1 h after irthere would find that the expres sion of bax protein in outer layer was stronger than in inner layer，then the expression of bax protein was weak

6、en graduallyconclusion m aybe bax gene is a important regulative gene in the proc ess of apo ptosis，these changes observed in the presentsudy might be useful for the f0rensic pathological diagnosis of the early myocardial ischemiareperfusion【key words】 myocardial reperfusion injury；bax protein；immun

7、ohistochemistry；forensic pathology缺血能導(dǎo)致組織損傷甚至細胞死亡，而缺血后再灌注又能引起新的損害，即所謂的再灌注損傷 j。心肌缺血再灌注損傷經(jīng)歷兩個獨特而又相關(guān)聯(lián)的病理過程：內(nèi)皮觸發(fā)與中性粒細胞放大。再灌注早期的主要病理生理改變是內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，         它以內(nèi)皮一氧化氮釋放明顯降低為特征，這種內(nèi)皮功能狀態(tài)的改變可引發(fā)一系列的病理生理變化，開始再灌注損傷的病理過程 2 j，這就是所謂的“內(nèi)皮觸發(fā)機制”；緊接著再灌注過程中的第二個主要病理生理改變即“中性粒細胞放大作用”。本

8、實驗，通過觀察大鼠心肌組織，在心肌缺血后再灌注的不同時間段的bax蛋白的表達規(guī)律，以期能為心臟缺血再灌注損傷及其引起猝死的法醫(yī)學(xué)診斷提供依據(jù)。材料與方法一、實驗動物分組成年wistar大鼠30只(由南京藥科大學(xué)提供)，自然光照，室溫飲食，飲水不限。隨機分為6組，每組5只，雌雄不限，質(zhì)量200 g左右。分為斷頸處死組、心肌缺血15 min后再灌注05 h組、1 h組、2 h組、4 h組和6 h組。二、動物模型的制備根據(jù)文獻3的方法并加以改良，大鼠乙醚麻醉后上腹帶加壓，呼吸機常壓口腔通氣并維持麻醉。暴露心臟，從左心耳下緣進針，動脈圓錐左緣出針，線兩端穿過一段雙聚乙烯管，拉緊絲線兩端，壓緊心肌表面并

9、夾緊，根據(jù)心電圖判斷血流是否阻斷，持續(xù)阻斷15 rain，松開止血鉗實施再灌注。逐層關(guān)胸，切口放少量青霉素，分籠飼養(yǎng)。三、梗死區(qū)域的判定采用1vrc染色法，沿心臟左室長軸切塊，加1ttc溶液，37 水浴15 min，置于4多聚甲醛溶液中。四、bax免疫組織化學(xué)bax一抗體(美國sigma生物試劑公司)sabc試劑盒、dab顯色劑(武漢博士德公司)。各組心臟標本石蠟切片厚5衄，免疫組化染色，按照說明書的操作步驟進行。pbs取代一抗作陰性對照。五、圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理形態(tài)計量法方法：每組測定5張切片，每張切片取5個視野，以視野數(shù)為單位，每組共25個視野，用hpias一1000高清晰彩色病理圖像測量

10、系統(tǒng)進行測量，選取平均光密度值(optical density，od)為定量參數(shù)，測定bax蛋白的表達。結(jié) 果一、常規(guī)he染色正常對照組和不同時間缺血再灌注組心肌細胞均染色清世圳 詘 但 tll “二 x免疫組織化學(xué)染色0叭i ji腰f !itl_ij q灌往i hn 1 j 蠕刊“x噩ii 他點j l 【口 眥1c-l兒oq十 (0h j；!) i #iii f h垃 i】1 l )l r¨ 1·5 心 t， l lj l， l4 斷 何濰- 塒 1蚺蜒長1qj【 心地l戰(zhàn)竹 m 件邑 忸 打眥 li 瑚i 矗 埡衙 ) l 是一 【也l 、 i rlm ¨ 1

11、 ， i 缺 【恥 il喪 l 也 i 【l1 仇 蠢lj1 0 m i i¨】l he h 0f¨l vu1 鼬、i11 ii m缺 再 i i r 0m蜘胞胞 c rc a1 】 l l ur i fhe x1)r p ll ln in ul，ni“l(fā)n ill nl l i11i'rl i n n l i i1eirli討論鼻j獻¨ 倆 ili 0d 清楚川l瀚ri 一i 仃 制1 蒙j lit j 眥械氧川 u 此“ i nl iii灌汁 11 【9 【 i¨ 缺 【 r j _j f lii 址防ll=f l jh提供| - 帥l、&#

12、168; h¨i iill r m i ffj計r機制孫 ll一tl, 他刪 帕m洲 t h 卅 州i他世 l 吶#求i_：l i 瞅 恫t i1j忸州 lr艄札蛹i jil i l!j叭【m、 jl j 川i 家她吶l止“ i l !" 皿" f十ii；lxt ，k j ¨j【lj l i 時 j i j n0州“n川fn j ti f j j n 鰣1 - fi¨ 體帆川尚 、訥世 i -i 1 j 吁州i岫 iil “ i kk 肌lj ”n ¨ h lktill li 【j li 認 ihl !ifi1i仲rill j

13、8;【"暗 j il "礎(chǔ) 靶 什iil 、 * 】llli 喘 l j 世 4 i nt l0 兒h j】 f1 j l i 竹cj i'、 1 jf l¨地 h| 缺m k訛 j j越自【魁叫i m 碟j= 1 ： ¨們恤 i 牌1 州i i川眥 【 fill_¨持絀川jhifj戈i j肚 【脛挑 i h 協(xié)l'l!jy rllit螗ii ¨ 訂 川i_l f 端¨ 【li拈術(shù) 泄n 觀t1叭卦¨魁 l'lj ，fi l】 能說i 性仃 呲 i' 州h ： n m j f 、 川

14、 0 i 疊 l自 j* ¨f|lj i心 i 的 c眥 心iii【 ”j f 曲¨¨ l刊l ¨q c 7ill!jl t 11川fit ¨f十【l制 土m j盯心 l缺 灌h l竹致心 伴 f h l】桃玎_jt 陸 i世4 j 心喹造卅 j j i 4借求璀凡1h唯l銣坩木艟 種d毗hr 刊特 懦刪 心jill缺 冉口 怫邶忙 畢垃勝 斷似然世 一 蜘域rl_岫凡 究趕 兩馴 h 1 d l·小，¨ r 蚩由最選fl城ii i】jli j m j l 強慣 地i 心冉檀凡隼諍i 燈 l小獻mi 餿 脅 瞎晰扼 順輔l償

15、斷他據(jù)# 女讎tif,ji k ·1·l 】 】i r1 itk,i j jll_lii|i11lcl h 兒1 dlii l “|_ ii【i ni rihi ¨·t l l 1 ：i ¨ ¨l allc ii ii j【j uqj i：i 、i 5ij i 1 ww i 一h wi ¨ i 、 f hij 【i 1¨ttr 1i 【 rf1f i¨v ii1 【 v r i d ¨¨ 1_ r-i·(】i j】【i h ii c l iiliiii f j ：i ¨ f1iij i i 、 、 _ |_ ii ii【l i i- 【 i lii【-f l l l ll'l jl-ti 1|1、i l川1 、l _|j j i h i 1 lii ii jii fv ii -ii-i j l h1ji iii r¨ 、i w i l rl t。一1 i 、 |_ji ；i1 t r