損傷反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)成年大鼠室下區(qū)的再生作用

1、損傷反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)成年大鼠室下區(qū)的再生作用    作者：屈建強(qiáng)賀西京楊平林楊濤    【摘要】 目的 觀察液壓性腦損傷后不同時(shí)期室下區(qū)Nestin和GFAP的表達(dá)及其細(xì)胞類型。分離腦損傷室下區(qū)Nestin /GFAP 共存細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化鑒定。方法 用液壓沖擊法建立SD大鼠動(dòng)物模型，用免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)法分析和顯示不同時(shí)期(1、3、5d，1、2、3、4、6、8周)Nestin和GFAP的表達(dá)變化以及細(xì)胞類型。分離液壓損傷SD大鼠室下區(qū)Nestin /GFAP 共存細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行培養(yǎng)、傳代

2、，以免疫熒光化學(xué)方法對(duì)原代和傳代培養(yǎng)形成的神經(jīng)球以及誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果 室下區(qū)免疫熒光染色：正常組及空白對(duì)照組在前腦側(cè)腦室SVZ區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞，主要集中在外側(cè)壁上部和上角，其他部位及三腦室的SVZ區(qū)有少量神經(jīng)干細(xì)胞。腦損傷模型組腦損傷24h后，和正常組相比，室下區(qū)Nestin和GFAP的表達(dá)顯著增加，陽性表達(dá)在3d后逐漸達(dá)到高峰，持續(xù)1周。在上述條件下培養(yǎng)及傳代的細(xì)胞不斷分裂增殖，形成懸浮生長的呈Nestin陽性的神經(jīng)球；神經(jīng)球貼壁后分化的細(xì)胞表現(xiàn)為少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，且分別呈GalC陽性、?tublin 陽性和GFAP陽性。結(jié)論 成年大鼠液壓性腦損傷可誘導(dǎo)室

3、下區(qū)表達(dá)Nestin和GFAP，Nestin的表達(dá)和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生呈正相關(guān)，且表達(dá)多相互共存，并且具有星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)；室下區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞都對(duì)腦損傷都有反應(yīng)，并可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)。成年大鼠液壓性腦損傷后分離的室下區(qū)細(xì)胞具有自我更新能力和多分化潛能，可以分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞。    【關(guān)鍵詞】 腦損傷；反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；再生；室下區(qū) Effects on regeneration in subventricular zone about injuriedreacti

4、ve astrocyte following brain injury in adult rats ABSTRACT: Objective Using immunohistochemical method and immunofluorescence, the expressions of Nestin and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in subventricular zone of rats with hydraulic injury, as well as its cell types were observed in differe

5、nt period. The coexisting cells of Nestin /GFAP were cultured and induced to differentiate. Methods Animal model was established by moderate lateral fluid percussion. Expression and cell types of Nestin and GFAP in different period (1d, 3d and 5d; 1w, 2w, 3w, 4w, 6w and 8w) were measured by immunohi

6、stochemical method and immunofluorescence. Coexisting cells of Nestin /GFAP were separated from subventricular zone of SD rats to make single cell suspension. And then, the cells were cultured and subcultured. Next, primary and subculturing neuronosphere as well as primary and subculturing different

7、iated cells were measured with immunofluorescence. Results Immunofluorescence staining results: For normal controls, small nerve stem cells of round or fusiform shape appeared in SVZ of prosencephalon lateral ventricle, mainly in upper part of lateral wall and corn. Few nerve stem cells were located

8、 in SVZ of lateral ventricle and 3rd brain ventricle. Brain injury: 24 hours after brain injury, expression of Nestin and GFAP increased obviously and reached the peak value 3 days later, and lasted for 1 week. Subcultured cells proliferated and positive?Nestin neuronosphere formed. Differentiated c

9、ells were oligodendrocytes (positive?galactocerebroside), neurons (positive?tublinIII) and orastrocytes (positive?GFAP). Conclusion Hydraulic injury can induce the expression of Nestin and GFAP in brain ventricle sub?area of rats.The expression of Nestin has a positive correlation with reactive astr

10、ocyte regeneration and coexists with the form of astrocytes. Both astrocytes and nerve stem cells in brain subventricular zone can be responsive to injury and possibly take part in repair of CNS. Cells separated from brain subventricular zone have a great ability in differentiation and self?renewing

11、. These cells can differentiate into neurons, oligodendrocytes or astrocytes. They are stem cells of CNS. So, injury reactive astrocyte can repair CNS through regenerating the subventricular zone in adult rats. KEY WORDS: brain injury; reactive astrocyte; neural stem cell; regeneration; subventricul

12、ar zone    神經(jīng)干細(xì)胞在成年動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中的存在，打破了CNS損傷后神經(jīng)元不能再生的觀念，使CNS損傷修復(fù)成為可能。而尋找干細(xì)胞資源是CNS損傷修復(fù)的關(guān)鍵。近年來研究表明，成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的某些星形膠質(zhì)細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞的特性，經(jīng)過分離、純化及體外培養(yǎng)能轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元和(或)星形膠質(zhì)細(xì)胞1?3。    我們用液壓沖擊法建立SD大鼠腦損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，觀察腦損傷后不同時(shí)期室下區(qū)巢蛋白(neuro

13、epthelial stem cell protein, Nestin)和膠質(zhì)酸性纖維蛋白(glia fibrillary acidic protein, GFAP)的表達(dá)及其細(xì)胞類型，對(duì)腦損傷后Nestin 與GFAP 共存細(xì)胞表達(dá)高峰期(5-7d)的室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并觀察其特性。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年8周齡Sprague?Dawley大鼠66只，清潔級(jí)，雄性，體重300-350g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(6只)和腦損傷模型組(54只)，其中模型組造模后分為1、3、5d，1、2、3、4、6、8周小組，每小組6

14、只。所有動(dòng)物均在室溫下飼養(yǎng)。 1.2 動(dòng)物模型的建立 腦損傷模型組動(dòng)物按文獻(xiàn)4的方法，通過液壓裝置驟然改變密閉顱腔內(nèi)的壓力而間接造成腦損傷。液壓裝置由圓形液柱、打擊架、示波器和壓力傳感器組成。壓力大小可由打擊錘的高度調(diào)節(jié)并通過壓力傳感器在示波器上顯示，兩者保持完全一致。為排除手術(shù)和麻醉的干擾，動(dòng)物在致傷前24h行顱骨鉆孔硬膜外埋置打擊管，并用牙托水泥固定。打擊術(shù)式：以0.2MPa的壓力沖擊右側(cè)頂葉皮質(zhì)造成中度側(cè)位液壓沖擊腦損傷。假手術(shù)組做法同上，不用液壓沖擊。    1.3 取材及標(biāo)本的制備 在沖擊后不同時(shí)間(1、3、5d，1、2、3、4、6、8周)，用

15、0.12mol/L的苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉(30mg/kg)，無菌條件下，經(jīng)左心室快速灌注肝素生理鹽水約100mL，然后用40g/L的多聚甲醛300-500mL進(jìn)行灌注，灌注完畢后取室下區(qū)腦組織。在4下將腦移入40g/L的多聚甲醛里固定6h，然后依次移入0.58、0.88mol/L的蔗糖中直到沉底，并行水平面冰凍切片(厚14m)備用。 1.4 化學(xué)、生物試劑 改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco?s modified Eagle?s medium，DMEM)/F12(11)、胎牛血清、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)均購自美國GIBCO公司；B27添加劑

16、、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、多聚賴氨酸、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)酶均購自美國Sigma公司；Nestin抗體、GFAP抗體、?微管蛋白(?tublin )抗體均購自北京中山生物有限公司；半乳糖腦苷脂(galactocerebroside, GaLC)抗體購自美國Chemicon公司；抗兔免疫球蛋白G?異硫氰酸熒光素(immunoglobulin G?fluorescein isothiocyanate, IgG?FITC)、抗小鼠免疫球蛋白G?四甲基若丹明

17、異硫氰酸鹽(immunoglobulin G?tetramethyl rhodamine isothiocyanate, IgG?TRITC)、抗小鼠IgG?FITC、抗兔IgG?TRITC均購自德國羅氏公司。 1.5 腦組織切片組織化學(xué)染色 腦組織切片分為3組。第1組用常規(guī)甲苯胺藍(lán)染色，以分析腦損傷的范圍及程度。第2組行免疫熒光單標(biāo)染色，取組織切片與兔抗大鼠Nestin抗體(15000)4孵育過夜，抗兔IgG?FITC(1100)37孵育1h；另取組織切片與小鼠抗大鼠GFAP抗體(1200)4孵育過夜，抗鼠IgG?TRITC(1100)37孵育1h，甘油明膠封片后用熒光顯微鏡觀察。用抗體稀釋

18、液替代抗體處理腦片作陰性對(duì)照。第3組行免疫熒光組織化學(xué)雙重標(biāo)記，選取損傷后不同時(shí)期的腦片經(jīng)兔抗大鼠Nestin(15000)抗體孵育，抗兔IgG?FITC(1100)37孵育1h后再用小鼠抗大鼠GFAP抗體(1200)4孵育過夜，再分別用抗兔和抗鼠IgG?TRITC(1100)37孵育1h后立即封片。 1.6 室下區(qū)細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將腦損傷術(shù)后5-7d內(nèi)的成年大鼠，用0.12mol/L的苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉(30mg/kg)，無菌條件下暴露腦，以室下區(qū)為中心，迅速切取長約1.0-1.5cm腦組織，置入冰冷的D?hanks液中，待腦完全冷卻變硬后，沿側(cè)腦室面切取室下區(qū)，將室下區(qū)組織盡量剪成0-1

19、mm3的組織碎屑。用巴斯德吸管將碎屑移入含有1g/L的胰蛋白酶、0.67g/L的透明質(zhì)酸酶和0.1g/L DNA酶的混合酶液中，在培養(yǎng)箱(37，95% O2和5% CO2)中消化30min后，移入預(yù)先已加有等體積的1.25g/L的大豆胰酶抑制劑的離心管內(nèi)，反復(fù)吹打后銅網(wǎng)過濾。將濾液800r/min離心5min，棄上清液?；A(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，800r/min離心5min。重復(fù)5-6次后，用神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞活力后，調(diào)整細(xì)胞密度為約5000-10000個(gè)/mL，種入培養(yǎng)瓶內(nèi)懸浮培養(yǎng)。接種24h后換一次培養(yǎng)液，以后每隔7d半量換液。以上過程均在無菌間內(nèi)完成。 1.7

20、單細(xì)胞懸液中細(xì)胞類型的鑒定 用巴斯德吸管吸取0.5mL的單細(xì)胞懸液接種在事先用層粘連蛋白(5ng/L)包被的蓋玻片上，37孵箱培養(yǎng)(95% O2和5% CO2)2h后，取出蓋玻片，用冷的40g/L多聚甲醛固定30min，0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)反復(fù)漂洗數(shù)次后，行抗Nestin/GFAP免疫雙重染色，以了解這些單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞類型。 1.8 神經(jīng)干細(xì)胞的自我增殖能力鑒定 培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球用機(jī)械法傳代。在解剖顯微鏡下小心地用巴斯德吸管將細(xì)胞球盡量吹散(注意操作應(yīng)輕柔)，形成單細(xì)胞懸液后移入離心管中，800r/m

21、in離心5min，棄去上清液，然后用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后種入培養(yǎng)瓶中。 1.9 誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球接種在包被有多聚賴氨酸(5ng/L)的蓋玻片上，用含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)18-24h后選擇貼壁比較牢靠的干細(xì)胞和分化不同時(shí)期的蓋玻片，放入40g/L多聚甲醛中固定30min。經(jīng)用0.0lmol/LPBS(pH 7.4)徹底清洗后，隨機(jī)分為4組：第一組行抗Nestin免疫染色；第二組行抗GFAP免疫染色；第三組行抗?tubulin III免疫染色；第四組行抗GalC免疫染色。大致步驟如下：取細(xì)胞片與小鼠抗大鼠Nestin抗體(1500

22、0)4孵育過夜，抗小鼠IgG?FITC(1100)37孵育1h；取細(xì)胞片與小鼠抗大鼠GFAP(1200)4孵育過夜，抗小鼠IgG?TRITC(1100)37孵育1h；取細(xì)胞片與小鼠抗大鼠?tubulin (1100)4孵育過夜，抗小鼠IgG?TRITC(1100)37孵育1h；取細(xì)胞片與兔抗大鼠galactocerebroside(1200)4孵育過夜，抗兔IgG?FITC(1100)37孵育1h。然后用0.01mol/L PBS充分漂洗后，熒光封片劑封片后，用熒光顯微鏡觀察。用抗體稀釋液替代上述抗體處理細(xì)胞片作陰性對(duì)照。 1.10 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 成年正常及假手術(shù)組大鼠，在無菌間內(nèi)切取大致同樣長度

23、、同樣部位的室下區(qū)組織后，然后如前所述獲取單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5000-10000個(gè)/mL，然后種入培養(yǎng)瓶內(nèi)懸浮培養(yǎng)。 2 結(jié)果 2.1 室下區(qū)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 正常組及空白對(duì)照在前腦側(cè)腦室室下區(qū)(subventricular zone, SVZ)出現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞，主要集中在外側(cè)壁上部和上角，細(xì)胞排列較整齊，胞體較小，多為卵圓形、梭形，其突起伸向四周。側(cè)腦室其他部位及三腦室SVZ有少量神經(jīng)干細(xì)胞，但排列稀疏。腦損傷組腦損傷24h后，和正常組(圖1)相比，室下區(qū)Nestin和GFAP的表達(dá)顯著增加，陽性表達(dá)在3d后逐漸達(dá)到高峰，持續(xù)到1周，且用激光共聚焦顯微鏡觀察到了熒光雙標(biāo)的陽性信號(hào)，即

24、Nestin 和GFAP 共存細(xì)胞，并具有星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(圖2)。隨著時(shí)間的推移，陽性表達(dá)逐漸減弱，乃至消失。    2.2 室下區(qū)細(xì)胞分離培養(yǎng)、傳代、誘導(dǎo)分化的結(jié)果 原代培養(yǎng)在相差顯微鏡下觀察，可見散在分布圓形或卵圓形的單個(gè)細(xì)胞。它們大多單個(gè)存在，邊緣光滑，折光度好，無細(xì)胞突起，細(xì)胞中央相當(dāng)于核染色質(zhì)的部位在相差顯微鏡下大多發(fā)暗。細(xì)胞接種3d后，在培養(yǎng)瓶中可發(fā)現(xiàn)有一些小的干細(xì)胞克隆球，在相差顯微鏡下仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)其由數(shù)個(gè)細(xì)胞緊密聚集而成。它們大小接近，細(xì)胞邊緣光滑、中心膨隆有立體感。因而，在形態(tài)上和簡單的細(xì)胞聚集有顯著差別。在培養(yǎng)14d時(shí)，這些干細(xì)胞克

25、隆球即已清晰可見(圖3)。    為證實(shí)這些細(xì)胞球的確是神經(jīng)干細(xì)胞克隆球，我們對(duì)它們進(jìn)行了多次傳代。結(jié)果獲得了大量的細(xì)胞克隆球(圖4)，且數(shù)目明顯增多，表明這些細(xì)胞球確實(shí)是神經(jīng)干細(xì)胞克隆球，并且具有極強(qiáng)的自我增殖能力。    誘導(dǎo)分化18h后行免疫熒光標(biāo)記顯示這些細(xì)胞球強(qiáng)烈表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物?Nestin，免疫染色呈強(qiáng)陽性。誘導(dǎo)分化3d時(shí)，galactocerebroside染色結(jié)果證實(shí)這些細(xì)胞球中含有大量的galactocerebroside免疫染色陽性的細(xì)胞，形態(tài)與少突膠質(zhì)細(xì)胞極為相似，但GFAP和?

26、tubulinm III染色結(jié)果均為陰性。誘導(dǎo)分化5-7d左右，?tubulinm III染色結(jié)果證實(shí)這些細(xì)胞球中含有大量的?tubulinm III免疫染色陽性的細(xì)胞，并且具有神經(jīng)元形態(tài)，提示它們可能是朝神經(jīng)元方向定向分化的前體細(xì)胞。從干細(xì)胞克隆球內(nèi)遷延出來并向周圍放射狀伸展的細(xì)胞中大多也為?tubulinm III染色陽性。GFAP染色結(jié)果則與?tubulinm III染色結(jié)果相類似，在熒光顯微鏡下觀察可以看到細(xì)胞球內(nèi)有很多GFAP染色陽性的胞體和細(xì)胞突起。和?tubulinIII染色結(jié)果相比，GFAP單標(biāo)的細(xì)胞出現(xiàn)比較晚，但數(shù)目較多。從而，提示這些神經(jīng)干細(xì)胞朝星型膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的速度可

27、能要快于朝神經(jīng)元的方向分化的速度。 圖1 正常成年大鼠室下區(qū)Nestin、GFAP的表達(dá)及Nestin和GFAP的共表達(dá)（略） Fig.1 Photographs showing the expression of Nestin, GFAP and the co?expression of Nestin and GFAP in normal rat subventricular zone (×200) A: Nestin (green); B: GFAP (red); C: co?expression of Nestin and GFAP (yellow) 圖2 損傷后7d室下區(qū)Ne

28、stin、GFAP的表達(dá)及Nestin和GFAP的共表達(dá)（略） Fig.2 Photographs showing the expression of Nestin, GFAP and the co?expression of Nestin and GFAP in the injured brain after 7 days following injury caused by moderate lateral fluid percussion (×200) A: Nestin (green); B: GFAP (red); C: co?expression of Nestin an

29、d GFAP (yellow) 圖3 神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)10d后形成神經(jīng)球（略） Fig.3 NSCs formed neurospheres after primary culture for 10 days (×200) 圖4 神經(jīng)干細(xì)胞次代培養(yǎng)14d后形成神經(jīng)球（略） Fig.4 NSCs formed neurospheres after secondary culture for 14 days (×200) 3 討論    Nestin是胞漿中間絲狀蛋白，屬于細(xì)胞骨架的一種，可作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，主要存在于胚胎腦組織

30、中，在成熟大鼠和成人的某些區(qū)域也存在。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)成年腦內(nèi)海馬齒狀回和室管膜下區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞5?7。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異蛋白和骨架成分之一，并可作為其特異性標(biāo)記。Holmin等8利用GFAP蛋白和Nestin蛋白雙標(biāo)機(jī)械性腦損傷大鼠腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，Nestin蛋白既可在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，又可在非反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，且Nestin蛋白在CNS損傷的最初期就有表達(dá)，遠(yuǎn)早于GFAP蛋白。本研究結(jié)果顯示，成年大鼠側(cè)腦室SVZ區(qū)存在有神經(jīng)干細(xì)胞，主要集中在外側(cè)壁上部和上角，側(cè)腦室其他部位及三腦室的SVZ區(qū)亦有少量神經(jīng)干細(xì)胞，但排列稀疏。液壓性腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞明顯表達(dá)與增殖

31、。腦損傷24h后，和正常組相比，室下區(qū)Nestin的表達(dá)顯著增加，陽性表達(dá)在3-7d后逐漸達(dá)到高峰，持續(xù)到1周。同時(shí)，用GFAP免疫單標(biāo)觀察到GFAP的表達(dá)變化與Nestin的表達(dá)變化極為相似。但是，Nestin稍早于GFAP蛋白。免疫熒光雙標(biāo)觀察到部分Nestin陽性細(xì)胞與GFAP共存，根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)顯示它們是星形膠質(zhì)細(xì)胞及反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞。本結(jié)果表明，Nestin蛋白可在腦損傷后室下區(qū)正常的膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，腦損傷后又可以在增生的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。雖然腦損傷后誘導(dǎo)Nestin和GFAP大量表達(dá)的機(jī)制還不十分清楚，但該表達(dá)可能是膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)損傷的直接反應(yīng)，也可能是膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化，如細(xì)

32、胞因子、生長因子、細(xì)胞外離子和氨基酸改變的繼發(fā)反應(yīng)。這種損傷后不同時(shí)期Nestin和GFAP表達(dá)變化不一，也可能是神經(jīng)細(xì)胞抵御損傷的繼發(fā)性保護(hù)反應(yīng)。損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生誘導(dǎo)Nestin表達(dá)的作用提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后與發(fā)育相關(guān)的基因被激活，并可能參與神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。    作為神經(jīng)干細(xì)胞，根據(jù)1997年Mckay9在Science上發(fā)表的文章認(rèn)為，就是指具有分化為神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cells)是相對(duì)于干細(xì)胞而言，其分化能力和自我維

33、持、自我更新能力受到限制，僅具有單潛能或雙潛能分化能力或其干細(xì)胞樣特性只能維持較短的時(shí)間。    多分化潛能是神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)基本屬性。在本實(shí)驗(yàn)的前部分，我們分離腦損傷后室下區(qū)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，證明了克隆細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，即多分化潛能，這與多家實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果相同11?13。為確切證明神經(jīng)干細(xì)胞的多分化潛能，本實(shí)驗(yàn)使用單個(gè)細(xì)胞形成的克隆連續(xù)傳代得到大量克隆以證實(shí)單個(gè)細(xì)胞的多分化潛能。    自我更新是神經(jīng)干細(xì)胞的又一基本屬性。所謂自我更新，指將干細(xì)胞樣屬性從親代細(xì)胞傳遞到子代細(xì)胞，即在

34、分裂增殖過程中子代細(xì)胞仍然維持干細(xì)胞屬性10。本實(shí)驗(yàn)中分離的細(xì)胞群顯然具有很強(qiáng)的自我更新能力，在連續(xù)傳代過程中子代細(xì)胞依舊保持了親代細(xì)胞的干細(xì)胞樣屬性，包括分裂增殖能力、多分化潛能和表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白。而且，這種自我更新能力維持了相當(dāng)長的時(shí)間(傳代>15代，時(shí)間>3M)。克隆形成實(shí)驗(yàn)表明1個(gè)克隆中大部分細(xì)胞不可避免死亡和分化，但仍有一部分細(xì)胞保持了干細(xì)胞樣屬性，表明這部分細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了從親代干細(xì)胞到子代干細(xì)胞的自我更新。    能不斷分裂增殖是神經(jīng)干細(xì)胞的重要屬性。在我們的實(shí)驗(yàn)中成年大鼠室下區(qū)原代培養(yǎng)細(xì)胞及次代培養(yǎng)細(xì)胞具有克隆能力，在連續(xù)傳代

35、培養(yǎng)中依舊維持了這種克隆能力。為排除多細(xì)胞聚集產(chǎn)生類似集落的可能性，我們采用了單細(xì)胞克隆的方法證明單個(gè)細(xì)胞能夠分裂增殖成為克隆。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Reynolds等11的結(jié)果相同，即單細(xì)胞克隆是完全可能的。同時(shí)，我們尚使用神經(jīng)上皮的特異性抗原?Nestin的抗體來證明我們所分離的細(xì)胞為胚胎早期細(xì)胞，因?yàn)镹estin的表達(dá)起始于神經(jīng)板的形成，在神經(jīng)遷移及神經(jīng)分化開始后逐漸消失14。因此，本實(shí)驗(yàn)中分離的細(xì)胞群具有自我更新能力和多分化潛能，表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白，有很強(qiáng)的分裂增殖能力，具備了神經(jīng)干細(xì)胞的基本屬性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞。    成體腦中神經(jīng)干細(xì)胞

36、的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)發(fā)育研究和中樞神經(jīng)功能重建提供了一條新的思路。從神經(jīng)板的出現(xiàn)、神經(jīng)管的形成到腦泡的發(fā)育都經(jīng)歷了從神經(jīng)干細(xì)胞到祖細(xì)胞再到成熟神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過程，而神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖、遷移與分化則無疑是其中最具代表性的環(huán)節(jié)。因此，研究神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化將為闡明神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的機(jī)制提供有力的證據(jù)15?17。其次，神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)退行性疾病如帕金森病的功能重建帶來了希望，無論是作為腦組織移植的供體，還是作為體內(nèi)誘導(dǎo)分化的靶細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞都為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生提供了一條新的途徑18。相信隨著人們對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞研究的不斷深入，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的研究一定會(huì)取得突破性

37、進(jìn)展，腦癱、脊髓損傷后截癱等臨床治療難題也必將得到解決。 【參考文獻(xiàn)】 1Doetsch F, Caille I, Lim DA, et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain J. Cell, 1999, 97(6):703?716.2Estivill TG, Pearson H, Van HV, et al. Pax6 is required to regulate the cell cycle and the rate of progression from

38、 symmetrical to asymmetrical division in mammalian cortical progenitors J. Development, 2002, 129(2):455?466.3Yagita Y, Kitagawa K, Sasaki T, et al. Differential expression of Musashi 1 and nestin in the adult rat hippocampus after ischemia J. J Neurosci Res, 2002, 69 (6):750?756.4張永亮，汪秉康，廖志鋼，等. 大鼠側(cè)

39、位液壓沖擊腦損傷動(dòng)物模型及病理學(xué)改變 J. 華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 30(4):363?367.5Johansson CB, Svensson M, Wallstedt L, et al. Neural stem cells in the adult human brain J. Exp Cell Res, 1999, 253(2):733?736.6Gage FH. Mammalian neural stem cells J. Science, 2000, 287(5457):1433?1438.7Dietrich J, Easterday MC. Developing concepts in neural stem cells J. Trends Neurosci, 2002, 25(3):129?131.8Holmin S, Almqvist P, Lendahl U, et al. Adult Nestin?expressing subependymal cells differentiate to astrocytes in response to brain injury J. Eur J Neurosci, 1997, 9(1):65?75.9Mc