項目二十二 變態(tài)反應(yīng)的檢驗技術(shù)

1、項目二十二變態(tài)反應(yīng)的檢驗技術(shù)一變態(tài)反應(yīng)的類型及檢驗原則變態(tài)反應(yīng)（allergy）是由免疫炎癥或其他免疫應(yīng)答機(jī)制所致的組織損傷或功能障礙，也稱為超敏反應(yīng)（hypersensitivity）。誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)的抗原稱為變應(yīng)原，可以是完全抗原，也可以是半抗原；可以是外來抗原，也可以是自身抗原。自身抗原引起的病理狀態(tài)又稱自身免疫病。按照發(fā)生機(jī)制的不同，變態(tài)反應(yīng)可分為4型（表16-1）。表16-1 變態(tài)反應(yīng)的分類比較型別別名發(fā)生機(jī)制主要相關(guān)疾病型即刻型、反應(yīng)素型、過敏反應(yīng)IgE/肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞介導(dǎo)的血管和平滑骨反應(yīng)支氣管哮喘、藥物過敏蕁麻診、過敏性鼻炎、過敏性休克等型細(xì)胞毒型，細(xì)胞結(jié)合抗原型IgG，

2、IgM/補(bǔ)體或粒細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解和吞噬等新生兒溶血癥、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜等型免疫復(fù)合物型免疫復(fù)合物/補(bǔ)體介導(dǎo)的組織炎癥血清病、皮膚血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等型遲發(fā)型（細(xì)胞介導(dǎo)型）超敏反應(yīng)TH細(xì)胞介導(dǎo)的浸潤性炎癥接觸性皮炎、移植排斥反應(yīng)、結(jié)核病等（一）型變態(tài)反應(yīng)誘導(dǎo)型變態(tài)反應(yīng)的抗原多是外源性的，例如花粉、塵螨、青霉素、食品等，可經(jīng)呼吸道、消化道或皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體，刺激機(jī)體產(chǎn)生IgE或IgG4，結(jié)合到肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上，使宿主進(jìn)入致敏狀態(tài)。變應(yīng)原再次進(jìn)入機(jī)體時，可與細(xì)胞表面的IgE或IgG4結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒，釋放炎癥介質(zhì)，引起一定部位的血管和

3、平滑肌反應(yīng)。相關(guān)疾病有：支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性胃炎、蕁麻疹、過敏性休克等。型變態(tài)反應(yīng)發(fā)生迅速，臨床常見的嚴(yán)重病例是青霉素引起的過敏性休克，如不及時搶救患者會很快死亡。但型變態(tài)反應(yīng)一般不引起組織損傷，所以刺激因素解除后康復(fù)也快。型變態(tài)反應(yīng)的檢驗有多種方法：皮膚試驗，例如青霉素皮試；激發(fā)試驗，例如支氣管激發(fā)試驗；血清IgE測定。型變態(tài)反應(yīng)的臨床診斷并不困難，實驗室檢查的主要目是明確過敏原，以采取適當(dāng)?shù)幕乇艽胧蛘弑匾獣r進(jìn)行特異性脫敏治療。（二）型變態(tài)反應(yīng)型變態(tài)反應(yīng)涉及的抗原比較復(fù)雜，藥物、病毒或自身抗原都可成為變應(yīng)原，刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG或IgM類抗體，抗體可特異性地結(jié)合到位于細(xì)胞表面的抗

4、原上，活化補(bǔ)體、溶解靶細(xì)胞、誘導(dǎo)粒細(xì)胞浸潤及吞噬作用。涉及的疾病有新生兒溶血癥、自身免疫性血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、重癥肌無力、部分腎小球腎炎、肺出血腎炎綜合征等。少數(shù)情況下，某些抗體與靶細(xì)胞結(jié)合可刺激靶細(xì)胞興奮，導(dǎo)致非常特殊的效果。例如抗體促甲狀腺素受體的抗體可使甲狀腺細(xì)胞過度分泌甲狀腺素而引起甲狀腺功能亢進(jìn)；有些抗體誘導(dǎo)ADCC作用引起慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺素等。這兩型特殊的型變態(tài)反應(yīng)曾被命名為型和型變態(tài)反應(yīng)。型變態(tài)反應(yīng)的檢驗主要是針對引起反應(yīng)的特異性抗體；但型變態(tài)反應(yīng)主要涉及血液系統(tǒng)疾病和自身免疫病，有關(guān)內(nèi)容參見血液學(xué)檢驗教材和本書第二十五章。（三）型變態(tài)反應(yīng)型變態(tài)反應(yīng)的抗原多是蛋

5、白質(zhì)分子，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量IgG和IgM類循環(huán)抗體，抗原與抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物（immunecomplex，IC）在一定條件下可沉淀于局部組織，激活補(bǔ)體引起炎癥反應(yīng)。涉及的疾病有血清病、結(jié)締細(xì)胞病及局部Arthus反應(yīng)等。型變態(tài)反應(yīng)的檢驗主要是檢測循環(huán)免疫復(fù)合物或組織固定的免疫復(fù)合物；還可進(jìn)一步檢測免疫復(fù)合物中的抗體特異性；有時候也可用皮膚試驗進(jìn)行測定。（四）型變態(tài)反應(yīng)型變態(tài)反應(yīng)是細(xì)胞免疫介導(dǎo)的炎癥，沒有抗體和補(bǔ)體參與，發(fā)生較為緩慢，所以又稱為遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）。涉及的疾病有接觸性皮炎、結(jié)核病、移植排斥性反應(yīng)等。型變態(tài)反應(yīng)的檢驗可從多方面進(jìn)行。要以用促有絲分裂原或結(jié)核菌素檢測T細(xì)胞的

6、敏感狀態(tài)；也可用抗原檢測機(jī)體的特異性致敏狀態(tài)；還可通過檢測細(xì)胞因子或者皮膚試驗的辦法進(jìn)行檢驗。二 動物實驗性過敏反應(yīng)豚鼠過敏反應(yīng)(Anaphylactic hypersensitivity of guinea-pig)【實驗原理】豚鼠過敏反應(yīng)屬于型變態(tài)反應(yīng)。先給動物注射小劑量異種蛋白，經(jīng)過一定的潛伏期，動物處于致敏狀態(tài)。當(dāng)?shù)诙斡幂^大劑量的相同抗原注射時，即激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒釋放多種生物活性介質(zhì)，使動物迅速產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)及至過敏性休克或死亡?！驹噭┖推鞑摹?動物體重200g左右的健康豚鼠。2馬血清、雞蛋清。3無菌注射器、針頭、酒精棉球等?！静襟E和方法】1取豚鼠2只，經(jīng)腹腔或皮

7、下注射10%馬血清(用生理鹽水稀釋)0.1ml。223周后，在上述2只豚鼠心臟內(nèi)注射，一只注射馬血清原液(不稀釋)，另一只注射雞蛋清，各2ml。 3注射后數(shù)分鐘內(nèi)密切觀察其反應(yīng)現(xiàn)象。 【結(jié)果判定】注射馬血清的豚鼠出現(xiàn)煩躁不安、抓鼻、聳毛、咳嗽、打噴嚏、氣急、呼吸困難、痙攣性跳躍、大小便失禁、站立不穩(wěn)等現(xiàn)象，重者在數(shù)分鐘內(nèi)死亡。將死亡豚鼠解剖，可見肺臟極度氣腫，脹滿整個胸腔。由于動物個體反應(yīng)性不同，有的反應(yīng)較輕，可幸免死亡。如果再注射馬血清也不出現(xiàn)反應(yīng)，此稱為脫敏狀態(tài)。但脫敏狀態(tài)是暫時的，大約2周后又處于致敏狀態(tài)。注射雞蛋清的豚鼠不出現(xiàn)任何反應(yīng)。【注意事項】心臟內(nèi)注射時，要固定好動物，以免劃破心

8、臟；當(dāng)見到注射器內(nèi)有回血時再注入抗原。【方法評價】豚鼠過敏試驗是一個經(jīng)典的動物過敏性休克試驗，方法簡單、重復(fù)性較好、穩(wěn)定、過敏現(xiàn)象明顯?！九R床意義】豚鼠過敏反應(yīng)現(xiàn)象與人類過敏性休克反應(yīng)相似。通過試驗加深學(xué)生對型變態(tài)反應(yīng)現(xiàn)象及發(fā)病機(jī)理的理解，提高對人類過敏反應(yīng)防治重要性的認(rèn)識。另外，也可用于抗過敏藥物的篩選?！舅伎碱}】1上述試驗的兩只豚鼠為什么會出現(xiàn)完全不同的反應(yīng)現(xiàn)象？2型變態(tài)反應(yīng)是如何發(fā)生的？ 四 血清總IgE的測定ELISA雙抗體夾心法(Total serum IgE assay) 【實驗原理】 將特異性羊抗人IgE抗體包被固相載體，然后與待檢血清中IgE結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)羊抗人IgE抗

9、體，經(jīng)洗滌，加底物顯色，其吸光度值與樣品中IgE含量成正比。待檢血清IgE的含量可從標(biāo)準(zhǔn)IgE測定制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得?！驹噭┖推鞑摹?標(biāo)本待檢血清2羊抗人IgE純化抗體(包被用)。3羊抗人IgE-HRP 用方陣滴定法確定最適濃度。4IgE標(biāo)準(zhǔn)參考品混合人血清，經(jīng)WHO國際IgE標(biāo)準(zhǔn)參考品標(biāo)定IgE含量。 5底物緩沖液取0.1mol/L Na2HPO4·12H2O(35.8g/L) 5.14ml、0.05mol/L檸檬酸(10.5g/L) 4.86ml，混勻，加入鄰苯二胺(OPD)4mg，置棕色小瓶中，臨用時加30% H2O2 4.0l，混勻。6包被液pH9.5 0.05mol/L

10、CB (Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g、NaN3 0.2g，加蒸餾水至1000ml)。7稀釋液pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(Tris 2.42g、1mol/L HCl 13ml，加蒸餾水至1000ml)。 8洗滌液含0.1% Tween-20的pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液。 9終止液2mol/L H2SO4。 10器材溫箱(或水浴箱)、酶標(biāo)測定儀、酶標(biāo)反應(yīng)板、微量加樣器、小吸頭等。【步驟和方法】1包被將羊抗人IgE純化抗體用包被液稀釋成10g/ml，加到酶標(biāo)反應(yīng)板各孔中，每孔200l，加蓋放4 24h。次日用洗滌液洗滌3次

11、，每次3min(下同)。甩干。2加樣A排孔依次加入連續(xù)倍比稀釋的IgE標(biāo)準(zhǔn)參考品200l(濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05IU/ml)。B排孔依次加入1:10、1:100的待檢血清200l，各設(shè)兩個復(fù)孔。同時設(shè)陰性、陽性血清對照，各加200l；空白對照加入稀釋液200l。加蓋置37 2h。洗滌，甩干。3加酶標(biāo)抗體 每孔加已稀釋的羊抗人IgE-HRP 200l，加蓋置372h。洗滌，甩干。4加底物每孔加底物液200l，置37暗處20min。5終止反應(yīng) 每孔加終止液50l。6測定結(jié)果 測定各孔A492值。 圖4-1

12、IgE標(biāo)準(zhǔn)曲線【結(jié)果判定】以標(biāo)準(zhǔn)參考品IgE含量(IU/ml)為橫對數(shù)坐標(biāo)，以各濃度的A值為縱算術(shù)坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-1)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品中IgE的相對含量，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中IgE的含量。IgE 1 IU=2.4ng 參考值范圍：男631±128 IU/ml (315535ng/ml) 女 337±60 IU/ml (312000ng/ml) 【注意事項】1本法的靈敏度為0.2IU/ml，最敏感且呈線性關(guān)系的范圍是3.1350IU/ml，如所測結(jié)果不在此范圍內(nèi)，可增減濃度后再行測定，以求得準(zhǔn)確結(jié)果。2包被用羊抗人IgE抗體、待檢血清稀釋度

13、、羊抗人IgE-HRP濃度及溫育時間均可影響本法結(jié)果，故需選擇其最適條件。3其它注意事項參見ELISA間接法。【方法評價】ELISA雙抗體夾心法測血清IgE簡便、快速，特異性強(qiáng)，敏感性高于血凝法， 是檢測抗原最常用的方法。【臨床意義】 血清IgE水平升高常與過敏性疾病和寄生蟲感染等疾病有關(guān)，可見于過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、寄生蟲感染、支氣管肺曲菌病、IgE骨髓瘤、急性或慢性肝炎、SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。血清IgE降低可見于低丙球蛋白血癥、IgE以外的骨髓瘤、惡性淋巴細(xì)胞性白血病、免疫缺陷病等?！舅伎碱}】 1ELISA雙抗體夾心法測定血清IgE時應(yīng)注意哪些問題? 2測定血清總IgE

14、有何臨床意義? 五循環(huán)免疫復(fù)合物的測定(Detection of circulating immune complex)(一)PEG比濁法【實驗原理】不同濃度的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，常用PEG 6000)能選擇性地沉淀不同的蛋白質(zhì)。當(dāng)其終濃度為3040g/L 時，能選擇性地沉淀循環(huán)免疫復(fù)合物 (circulating immune complex, CIC)。然后用分光光度計測定其吸光度，即可反映沉淀物的相對含量?！驹噭┖推鞑摹?1標(biāo)本 待檢血清 2pH8.4 0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(BBS) 稱取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 0.42

15、9g、硼酸(H3BO3) 0.340g，溶于100ml蒸餾水中。341g/L PEG溶液取4.1g PEG、10g NaF溶于100ml pH8.4 0.1mol/L BBS中。4器材分光光度計、離心機(jī)、試管、吸管等。【步驟和方法】1待檢血清用pH8.4 0.1mol/L BBS作1:3稀釋( 0.2ml血清+0.4ml BBS )。 2按表4-1加樣，此時PEG最終濃度為37.3g/L。表4-1 PEG比濁法測CIC方法測定管對照管稀釋血清(ml)0.20.241g/L PEG(ml)2.0PH8.4 BBS(ml)2.0 3按上表加好后混勻，置4冰箱1h后取出，置室溫1015min。4用分

16、光光度計測定，以BBS調(diào)零，測兩管A495值。5同法測定不同濃度AHG (聚合人IgG) A495值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?！窘Y(jié)果判定】待檢血清A值=測定管A值-對照管A值 正常血清CIC的A值為0.043±0.020(X±SD) 由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢血清中CIC的含量(相當(dāng)于AHG)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中CIC的含量?！咀⒁馐马棥?不同濃度PEG可沉淀不同分子量的免疫復(fù)合物。20g/L PEG能沉淀較大的CIC、40g/L PEG則沉淀較小的CIC，但濃度大于50g/L 時PEG選擇性沉淀CIC的特性即行消失，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。 24時CIC沉淀最佳，室溫每升高1，A值下降

17、0.2。因此應(yīng)注意溫度變化對結(jié)果的影響。3低密度脂蛋白、高球蛋白血癥或脂肪含量過高可引起濁度增加，故應(yīng)空腹采血。4標(biāo)本陳舊或反復(fù)凍融等均可影響檢測效果，故受檢血清一定要新鮮。4保存不能超過3天，-20保存有效期可適當(dāng)延長?！痉椒ㄔu價】 此法快速、簡便、敏感度AHG達(dá)20g /ml，但不能反映小分子免疫復(fù)合物的情況，重復(fù)性差，一般可用作CIC的篩選。CIC檢測方法較多，原理各不相同，結(jié)果也不盡一致， 最好采用多種方法同時進(jìn)行，以提高陽性檢出率。 【臨床意義】1對免疫復(fù)合物疾病有輔助診斷價值，如血清病、SLE、慢性活動性肝炎時CIC往往升高。 2對CIC的動態(tài)觀測有助于監(jiān)測某些疾病的發(fā)展，協(xié)助判斷

18、療效和預(yù)后。 3有助于探討研究型超敏反應(yīng)病的發(fā)病機(jī)理?！靖健?聚合人類-球蛋白(AHG)的制備 1將粗制人IgG 6.5mg溶于1ml PBS(PH7.4)中，置63作用20min。2取出，4 10000r/min離心30min，吸取上清液，分裝，-70保存。3如需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將上清液置于冰浴中融化，2000r/min離心15min，用 Lowry蛋白測定法定量測定AHG的濃度。在應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線之前應(yīng)將制備的AHG制劑同WHO標(biāo)準(zhǔn)試劑進(jìn)行比較。 (二)抗補(bǔ)體法【試驗原理】血清中有CIC存在時，可與本身C1結(jié)合，當(dāng)將此待檢血清56加熱1h，能破壞結(jié)合的C1，空出補(bǔ)體結(jié)合點。在加入豚鼠血清(補(bǔ)體)

19、時便可與之結(jié)合，致使后加入的致敏紅細(xì)胞不發(fā)生溶血或溶血程度減弱?！驹噭┖推鞑摹?標(biāo)本待檢血清。2補(bǔ)體經(jīng)補(bǔ)體滴定，求出其5CH50時的最適稀釋度，以此稀釋度稀釋補(bǔ)體。 (滴定方法見補(bǔ)體結(jié)合試驗)。 3熱聚合IgG 制備見PEG比濁法。4試劑pH7.37.4工作BBD、2.8%溶血素致敏SRBC(制備方法見補(bǔ)體結(jié)合試驗)。5器材冰箱、離心機(jī)、分光光度計、水浴箱、1ml吸管、試管等?！静襟E和方法】1將待檢血清56滅活60min，按表4-2操作。表4-2 抗補(bǔ)體法試驗測定管空白對照管冷工作BBD(ml)0.20.4待檢血清(ml)0.2補(bǔ)體(ml)0.40.4混勻，4作用60min。2.8%致敏血球(

20、ml)0.20.2混勻，置37水浴作用15min 2然后各加入3.0ml工作BBD，2500r/min離心5min，取上清，以工作BBD調(diào)零，測兩管A541值?！窘Y(jié)果判定】測定管A值比空白對照管A值小50%為陽性。若定量測定，將待檢血清和AHG分別作系列稀釋，按上表操作，分別確定待檢血清CH50時的稀釋度及AHG CH50時的含量。以下式計算血清中CIC的含量。CIC含量/ml=CH50時AHG含量/ml×待檢血清CH50時的稀釋倍數(shù)?！咀⒁馐马棥?待檢血清需加熱滅活后再測定，以破壞結(jié)合的C1，空出補(bǔ)體結(jié)合點，并破壞其中的補(bǔ)體。但需避免產(chǎn)生熱變性蛋白質(zhì)而造成人為假陽性。故需嚴(yán)格控制加

21、熱的溫度和時間。2豚鼠血清易受溫度影響而失活，應(yīng)分裝凍存于-20，一周內(nèi)使用，過期作廢。最好-70保存。切忌反復(fù)凍融。3補(bǔ)體在實驗前必須經(jīng)過認(rèn)真滴定，不然補(bǔ)體用量過大會出現(xiàn)假陰性，用量過小會出現(xiàn)假陽性。4工作BBD、致敏SRBC均應(yīng)新鮮配制。5待檢血清要新鮮，抽血后即行分離，應(yīng)防止細(xì)菌污染、溶血。如不在當(dāng)日檢測應(yīng)-20凍存。6本法只能檢出能與補(bǔ)體結(jié)合的CIC，抗補(bǔ)體的任何因素均能干擾本試驗。 【方法評價】此法簡便、靈敏度高，易在一般實驗室進(jìn)行。 【臨床意義】同CIC測定的PEG比濁法。 【附】CH50溶血標(biāo)準(zhǔn)管的制備取1ml 2.8% SRBC懸液，加7ml蒸餾水，使SRBC完全溶解，再加入2

22、.0ml 貯存BBD(見補(bǔ)體結(jié)合試驗)。取上述溶液0.5ml加入0.28% SRBC(用工作BBD將2.8% SRBC稀釋10倍即可)0.5 ml、工作BBD3.0 ml，離心后測A541值，即為CH50標(biāo)準(zhǔn)值。 【思考題】1抗補(bǔ)體法測CIC，待檢血清為什么需加熱滅活？2CIC的測定方法主要有哪些種類？各有什么特點？ 六 類風(fēng)濕因子的測定玻片膠乳凝集試驗(Rheumatoid factor assaylatex slide agglutination) 【實驗原理】 類風(fēng)濕因子(RF)是一組IgM類為主的抗變性IgG的自身抗體，它能與人或動物的變性IgG結(jié)合，而不與正常人IgG發(fā)生反應(yīng)。用聚苯

23、乙烯膠乳顆粒吸附人類變性IgG，成為致敏膠乳顆粒，然后檢測血清中的RF，據(jù)此有助于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的臨床診斷。本處只介紹玻片法。 【試劑和器材】 1標(biāo)本待檢血清、陽性血清、陰性血清。 2膠乳抗原 人變性IgG致敏的膠乳試劑。3pH8.2 0.1mol/L甘氨酸緩沖鹽水取甘氨酸0.75g、NaCl 0.85g加蒸餾水至100ml，再加1mol/L NaOH 0.20.3ml，調(diào)至pH8.2。4器材黑色方格反應(yīng)板、滴管、牙簽等。 【步驟和方法】1將待檢血清、陽性血清、陰性血清經(jīng)5630min滅活，用pH8.2 0.1mol/L甘氨酸緩沖鹽水作1:20稀釋，備用。2在黑色方格反應(yīng)板上依次分別加

24、入稀釋的待檢血清、陽性血清、陰性血清各 1滴(約50l)，然后每格加入膠乳抗原各1滴 (約50l)。3用牙簽分別充分混勻，23min后觀察結(jié)果。 【結(jié)果判定】1如出現(xiàn)凝集顆粒且液體澄清者為陽性，即RF陽性；如仍保持均勻膠乳狀為陰性反應(yīng)，即RF陰性。2若先在試管中將待檢血清作倍比稀釋，然后分別加在玻片上作上述試驗，可作半定量測定?！咀⒁馐马棥?試劑應(yīng)保存在4，切勿凍存。使用前應(yīng)使試劑接近室溫并搖勻。2測定時需同時作陰性、陽性對照，觀察時應(yīng)注意排除非特異性凝集。3所加液滴大小應(yīng)一致。4假陰性的出現(xiàn)：(1)存在非IgM類抗IgG抗體，其凝集效價較IgM類RF差，很可能被忽視。(2)IgM類RF與內(nèi)源

25、性IgG結(jié)合，形成可溶性免疫復(fù)合物，如它們親合力高，二者仍保持結(jié)合狀態(tài)?！痉椒ㄔu價】此法操作簡便，結(jié)果清晰容易判斷，敏感性高于血凝試驗，但特異性低于血凝試驗。主要用于檢測IgM類RF，對于其它Ig類RF不能檢出。【臨床意義】RA時RF的陽性檢出率為6090%，當(dāng)RA持續(xù)存在時陽性率增高, 類風(fēng)濕結(jié)節(jié)病人陽性率可達(dá)100%。但是RF檢測不是診斷RA的特異性試驗，許多疾病及少數(shù)正常人(尤其老年人)也存在RF，應(yīng)注意鑒別診斷。【思考題】1RF陽性有何臨床意義？2用此法檢測RF如何排除假陽性、假陰性的影響？ 七皮膚試驗皮膚試驗（skintest）簡稱皮試，是在皮膚的體內(nèi)免疫學(xué)試驗。當(dāng)試驗抗原進(jìn)入致敏者

26、皮膚時，皮膚中結(jié)合有IgE的肥大細(xì)胞或致敏T細(xì)胞就會與試驗抗原結(jié)合，引發(fā)即刻型或遲發(fā)型的皮膚超敏反應(yīng)。試驗抗原也可從注射部位進(jìn)入微血管，與循環(huán)中的相應(yīng)抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物可在局部沉積，激活補(bǔ)體引起炎癥。所以皮膚試驗主要用于檢測型和型變態(tài)反應(yīng)，有時也用于檢測型變態(tài)反應(yīng)。一、試驗準(zhǔn)備首先應(yīng)當(dāng)制備試驗用抗原，如有合格商品可直接購買?？梢宰鳛樽儜?yīng)原的物質(zhì)種類繁多，例如動物皮毛、家禽羽毛、鴿糞、昆蟲、螨類、真菌、花粉、雜草、物理粉塵和各種食品等都可能成為變應(yīng)原。不同抗原的制備方法不同，但一般包括以下幾個步驟：收集原料；粉碎與勻漿；脫脂與提??；過濾與分離；分裝保存。分裝保存之前應(yīng)對提取產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

27、首先必須經(jīng)過無菌試驗、急性毒性試驗和熱原檢查，保證提取產(chǎn)物無明顯的毒副作用；還要測定產(chǎn)物的蛋白含量，用凱氏定氮法或磷鎢酸沉淀法標(biāo)定出總氮單位或蛋白氮單位。變應(yīng)原的范圍很廣，難以做得完全，所以查找變應(yīng)原需依靠患者的病史和醫(yī)師的經(jīng)驗以將可疑范圍縮小,學(xué)樣成功的機(jī)會就大得多。一般醫(yī)院和衛(wèi)生所都能做藥物過敏試驗，多在注射室完成；防疫部位在一些免疫接種之前有時也要做皮膚試敏；其余的均在變態(tài)反應(yīng)科或檢驗科的專門實驗室。實驗室應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，除具備各種專用試驗器材之外，還應(yīng)備有意外搶救的藥品及設(shè)施。試驗部位應(yīng)清洗干凈，嚴(yán)格消毒，以免皮膚的不潔物引起非特異性反應(yīng)或感染。當(dāng)皮膚患濕疹、感染、皮炎或外傷時不宜進(jìn)行皮

28、膚試驗。正在或近日服用免疫抑制劑或抗組胺藥物者也不宜進(jìn)行皮膚試驗。二、試驗類型及方法皮膚試驗的最常用部位是前臂曲側(cè)，因此處皮膚較為光滑細(xì)膩，而且便于試驗操作和結(jié)果觀察。按正規(guī)作法，左右兩臂一側(cè)作試驗，另一側(cè)作對照。需要時也可選用上臂或背部皮膚。具體試驗方法可分為皮內(nèi)試驗（intracutaneoustest）、挑刺試驗（pricktest）和斑貼試驗（patchtest）。1皮內(nèi)試驗將試驗抗原與對照液各0.020.03ml用皮試針頭分別注入皮內(nèi)（不是皮下），使局部產(chǎn)生一個圓形小丘。當(dāng)同時試驗多種抗原時，相互間至少間隔4cm，以免強(qiáng)烈反應(yīng)時互相混淆結(jié)果。皮內(nèi)試驗的敏感性比其他皮膚試驗高，所用抗原

29、應(yīng)適當(dāng)稀釋，以免出現(xiàn)嚴(yán)重反應(yīng)；當(dāng)高可疑性抗原出現(xiàn)陰性結(jié)果時，應(yīng)逐漸加大抗原濃度進(jìn)行重復(fù)試驗。皮內(nèi)試驗是最常用的皮膚試驗，應(yīng)用范圍也很廣，幾乎各類抗原及各型反應(yīng)都可用皮內(nèi)試驗進(jìn)行測定，只是不同類型的反應(yīng)觀察結(jié)果的時間和判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不所不同。2挑刺試驗也稱點刺試驗或刺痕試驗。將試驗抗原與對照液分別滴于試驗部位皮膚上，用針尖透過液滴或在皮膚上輕輕地挑刺一下，以刺破皮膚但以不出血為度；1min后拭（吸）去抗原溶液。同時試驗多腫抗原時，千萬注意不要將不同的抗原液交叉混合，以免出現(xiàn)假陽性。挑刺試驗主要用于型變態(tài)反應(yīng)，該法雖比皮內(nèi)試驗法敏感性稍低，但假陽性較少，與臨床及其他試驗的相關(guān)性較強(qiáng)。劃痕試驗（sc

30、ratchtest）是挑刺試驗的一個變型，用三棱針或注射器針頭在皮膚劃一條或多條約1cm長的創(chuàng)痕。因為劃痕的輕重與長短難于掌握一致，故不常用。3斑貼試驗將試驗抗原直接貼敷于皮膚表面的方法。試驗抗原為軟膏時可直接涂沫在皮膚上；如為固體物時可用蒸餾水混合或浸濕后涂敷于皮膚上；如為水溶液則浸濕紗布后敷貼于皮膚上。所用抗原濃度以不刺激皮膚為原則，涂敷范圍以0.51cm為宜。涂敷后蓋以油紙或玻璃紙，用紗布或繃帶固定；如有明顯不適感可隨時打開查看，并進(jìn)行適當(dāng)處理。斑貼試驗主要是檢測型變態(tài)反應(yīng)，敏感程度雖然不太高，但假陽性較少，結(jié)果的可信度大。三、結(jié)果判定及分析1型變態(tài)反應(yīng)在抗原刺激后2030min內(nèi)觀察結(jié)

31、果。挑刺試驗的陽性反應(yīng)以紅暈為主，皮內(nèi)試驗的陽性反應(yīng)則以風(fēng)團(tuán)為主，判定標(biāo)準(zhǔn)見表16-2。表16-2 速發(fā)型皮膚試驗的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程度皮內(nèi)試驗挑刺試驗無反應(yīng)或小于對照無反應(yīng)或小于對照風(fēng)團(tuán)35min，紅暈20mm紅暈對照，20nm風(fēng)團(tuán)69mm，伴紅暈紅暈20mm，無風(fēng)團(tuán)風(fēng)團(tuán)1015mm，伴紅暈紅暈伴有風(fēng)團(tuán)風(fēng)團(tuán)15mm，紅暈伴偽足紅暈伴偽足和風(fēng)團(tuán)2型變態(tài)反應(yīng)在接觸抗原后4872h內(nèi)觀察結(jié)果。皮內(nèi)試驗的陽性結(jié)果以紅腫和硬結(jié)為主，斑貼試驗的陽性結(jié)果以紅腫和水皰為主。判定標(biāo)準(zhǔn)見表16-3。表16-3 遲發(fā)型皮膚反應(yīng)試驗的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程度皮內(nèi)試驗斑貼試驗無反應(yīng)或小于對照無反應(yīng)或小于對照僅有紅腫輕度經(jīng)

32、腫，搔癢紅腫伴硬結(jié)明顯紅腫，時有紅斑紅腫，硬結(jié)，水皰紅腫伴豆疹，水皰大皰或（和）潰瘍紅腫，水皰伴潰瘍有時候，機(jī)體對某變應(yīng)原可能同時存在多種類型的反應(yīng)。例如在做青霉素皮內(nèi)試驗時，30min內(nèi)觀察呈陰性反應(yīng)，但在58h可能會出現(xiàn)型變態(tài)反應(yīng)，反應(yīng)的外觀現(xiàn)象介于型與型變態(tài)反應(yīng)之間；甚至還可能出現(xiàn)型變態(tài)反應(yīng)。3假性結(jié)果在一定條件下，皮膚反應(yīng)的結(jié)果可能與機(jī)體的實際情況不符，即出現(xiàn)假陽性或假陰性等不真實的結(jié)果。出現(xiàn)假陰性的常見原因有：試驗抗原的濃度過低，或者因各種原因失效；試驗時正服用免疫抑制劑或抗組胺藥物（后者可通過設(shè)立組胺陽性對照而判斷出來；操作誤差，例如皮內(nèi)試驗時注射過深進(jìn)入皮下，注入抗原量過少等；皮

33、試季節(jié)選擇不當(dāng)，例如花粉季節(jié)過后，抗花粉抗體水平可下降。出現(xiàn)假陽性的常見原因有：試驗抗原不純，在提取、配制，甚至在試驗過程中被其他抗原污染，引起交叉反應(yīng)；試驗溶液配制不當(dāng)，過酸或過堿都會對皮膚產(chǎn)生非特異性刺激；皮膚反應(yīng)性過強(qiáng)，例如被試者患有皮膚劃痕癥，或者有既往過敏的痕跡等；操作不當(dāng)，例如注入少量空氣也可出現(xiàn)假陽性。四、應(yīng)用與評價皮膚試驗屬于活體試驗，雖然影響因素眾多，卻能反應(yīng)機(jī)體各種因素綜合作用的實際免疫狀態(tài)；并且簡單易行，結(jié)果的可信度大；這些優(yōu)點是其他方法難以替代的，所以在臨床和防疫工作中都經(jīng)常應(yīng)用。1尋找變應(yīng)原變態(tài)反應(yīng)防治的重要原則之一是回避變應(yīng)原，而回避的前提是明確變應(yīng)原，確定變應(yīng)原的

34、常用方法便是各種類型的皮膚試驗。例如支氣管哮喘和蕁麻疹等均可用皮膚試驗來。但食物過敏與皮膚試驗的相關(guān)性較差，這可能是因為食物的抗原提取液與腸吸收的物質(zhì)有所不同，或食物過敏并非IgE所介導(dǎo)；而且，食物過敏的變應(yīng)原容易發(fā)現(xiàn)，一般不必作皮膚試驗。2預(yù)防藥物或疫苗過敏對患者首次注射某批號的青霉素、鏈霉素或其它易過敏藥物之前，必須做過敏試驗；如果患者呈陽性反應(yīng)（即使是可疑陽性），就應(yīng)更換其他抗生素。注射導(dǎo)種抗血清（例如抗破傷風(fēng)血清和抗狂犬病血清）前也必須做過敏試驗，如果呈陽性反應(yīng)就需要換用精制抗體；或進(jìn)行脫敏治療（少量多次注射，使抗原逐漸中和血液中的抗體）。3評價宿主細(xì)胞免疫狀態(tài)在可疑免疫缺陷病、腫瘤或

35、器官移植進(jìn)，了解患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)對疾病診斷和預(yù)后判斷都有重要意義。這種情況下可以使用共用抗原結(jié)核菌素（OT或PPD）或雙鏈酶（SD-SK）進(jìn)行皮膚試驗；或使用人工合成的二硝基氯苯（DNCB）或二硝基氟苯（DNFB）等先進(jìn)行致敏再作皮膚試驗，這樣可消除抗原接觸史不同所致的誤差。4傳染病的診斷對某些可疑的傳染病，用某種病原體的特異性抗原進(jìn)行皮膚試驗可以起到診斷或鑒別診斷的作用。例如對布氏菌病和軟下疳等細(xì)菌感染、對某些病毒感染和真菌感染、以及某些寄生蟲感染均有一定的意義。另外，還有一些反應(yīng)機(jī)制不同于變態(tài)反應(yīng)的中和性皮膚試驗，例如診斷白喉的錫克（Schick）試驗和診斷猩紅熱的狄克（Dick）試驗等

36、。八激發(fā)試驗激發(fā)試驗（provocation test）是模擬自然發(fā)病條件、以少量致敏原引起一次較輕的變態(tài)反應(yīng)發(fā)作、用以確定變應(yīng)原的試驗。主要用于型變態(tài)反應(yīng)，有時也用于型變態(tài)反應(yīng)的檢查，尤其在皮膚試驗或其他試驗不能獲得肯定結(jié)果時，此法可排除皮膚試驗中的假陽性反應(yīng)和假陰性反應(yīng)。激發(fā)試驗或分為特異性激試驗和非特異性激發(fā)試驗。非特異性激發(fā)是用組胺或甲基膽堿做霧吸入，以觀察患者對型變態(tài)反應(yīng)的敏感性，從而進(jìn)行病因分析或療效判定；特異性激發(fā)是用抗原做試驗，對明確變應(yīng)原有一定價值。根據(jù)患者發(fā)病部位的不同，可以進(jìn)行不同器官的激發(fā)試驗，常做的是支氣管激發(fā)試驗（BPT）、鼻粘膜激發(fā)試驗和結(jié)膜激發(fā)試驗。一、支氣管激

37、發(fā)試驗1試驗方法 先用肺量計測定BPT前的肺通氣功能，常用指標(biāo)為第一秒用力呼氣量（FEV-1）和肺活量；然后用噴霧器將對照液和抗原液或者非特異性刺激劑輸出，患者直接經(jīng)口或用面罩吸入；吸入抗原后1520min復(fù)查FEV-1。無反應(yīng)者可加大抗原量繼續(xù)試驗。2結(jié)果判定 陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：明顯自覺癥狀，如胸部緊迫感和喘息等；肺部聞及哮鳴音；FEV-1下降20以上。反應(yīng)類型包括以下幾種：速發(fā)型，在十幾分鐘出現(xiàn)癥狀，為型變態(tài)反應(yīng)；緩發(fā)型，在612小時出現(xiàn)癥狀，為型變態(tài)反應(yīng)；遲發(fā)型，在24小時以后出現(xiàn)，為型變態(tài)反應(yīng)；多相反應(yīng)，速發(fā)反應(yīng)后又出現(xiàn)緩發(fā)及遲發(fā)反應(yīng)。3應(yīng)用及評價 BPT較皮膚試驗的特異性高，與

38、患者的病史、癥狀和過敏原吸附試驗的相關(guān)性較強(qiáng)。常用于確定支氣管哮喘的過敏原、檢驗新制劑的抗原性、評價平喘藥療效以及觀察脫敏治療的結(jié)果等方面。本法的缺點是每次只能測試一種抗原，要求有一定專門設(shè)備和技術(shù)，并需取得病人合作。4注意事項 BPT偶可引起嚴(yán)重的反應(yīng)，所用抗原濃度不宜過高，應(yīng)該由小到大遞增；試驗前必須做好系列搶救準(zhǔn)備，對反應(yīng)較重者，需及時吸入舒喘靈等氣管解痙劑或皮下注射腎上腺素。二、其他激試驗1結(jié)膜激發(fā)試驗 球結(jié)膜背景明亮、毛細(xì)血管組織排列整齊，反應(yīng)結(jié)果容易觀察，是一個較為理想的變態(tài)反應(yīng)試驗場所。將適當(dāng)濃度的變應(yīng)原浸液滴入患者一側(cè)眼結(jié)膜，另一側(cè)滴入生理鹽水作對照；1520min觀察結(jié)果。試驗側(cè)結(jié)膜充血、水腫、分泌增加、癢感，甚至出現(xiàn)眼瞼紅腫等現(xiàn)象者為陽性反應(yīng)。該試驗主要用于眼部變態(tài)反應(yīng)病的過敏原檢查。注意抗原液中任何