金納米粒子探針的合成及應(yīng)用(一)

1、金納米粒子探針的合成及應(yīng)用(一)    作者：馬立娜 劉殿駿 王振新【摘要】 由于金納米粒子（AuNPs）具有與大小、形狀和聚集程度相關(guān)的物理和化學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于各種生物分析和生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)中，并發(fā)展成具有高選擇性、高靈敏度的生物分析檢測手段。以AuNPs為探針的分析方法通常具有簡單、快速、靈敏度高的優(yōu)點，并能應(yīng)用于實際樣品檢測。本文綜述了目前生物分子修飾的AuNPs探針的合成及其在檢測金屬離子、小分子、DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)分析等方面的應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】 金納米粒子；探針；合成與修飾；評述Abstract During last decade，g

2、old nanoparticled(AuNPs)-based assays have been well-developed and widely used in biological analysis and biomedical detection because AuNPs have unique physical and chemical properties which depend on the size，shape and degree of aggregation.The AuNPs-based assays have already been employed for det

3、ecting practical samples with high simplicity and selectivity.This review discusses the recently development of the synthesis and biological molecular functionalisation of AuNPs and their applications on the heavy metallic cations，small organic compounds，nucleic acids and proteins detection and cell

4、ular analysis.Keywords Gold nanoparticles；Probe；Synthesis and functionalization；Chemical sensing；Review1 引言納米技術(shù)與化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的結(jié)合，對分析科學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的超靈敏檢測和成像方法的發(fā)展起著越來越重要的作用15。由于AuNPs具有獨特的光學(xué)性質(zhì)（表面等離子體吸收和共振光散射）、易進行表面修飾以及良好的生物相容性（通常認(rèn)為裸AuNPs是無生物毒性的，而修飾后的AuNPs的生物毒性由其配體決定），因此功能化AuNPs的應(yīng)用領(lǐng)域不斷被拓寬，特別是其在生物分析和生物醫(yī)藥等領(lǐng)

5、域的應(yīng)用引起了人們廣泛關(guān)注2，3。本文綜述了生物分子修飾的AuNPs探針的合成及其在檢測金屬離子、小分子、DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)分析等方面的新進展，以若干應(yīng)用實例突顯一些技術(shù)突破及發(fā)展趨勢。2 金納米粒子的合成、穩(wěn)定性和功能化2.1 金納米粒子的合成方法金納米粒子的制備方法可分為化學(xué)法和物理法?；瘜W(xué)法是以金的化合物為原料，在還原反應(yīng)生成金納米粒子時控制粒子的生長，使其維持納米尺度?；瘜W(xué)合成法包括氧化還原法、電化學(xué)法、晶種法、模板法、微乳液法、微波合成法和光化學(xué)法等2，其中最具代表性并被廣泛應(yīng)用的有：（1）Turkevich-Frens法6，7，即在100 下，通過改變還原劑（檸檬酸鈉）和三價金

6、的化合物（氯金酸或氯金酸鈉）的比例來控制AuNPs粒徑的大小，從而獲得粒徑在1060 nm范圍內(nèi)且分散性較好的AuNPs。該方法制備程序簡單，且包裹在AuNPs表面的檸檬酸根容易被其它配體置換（如巰基修飾的DNA等）2，4；（2）Brust-Schiffrin法8，9，即在兩相（液/液）體系或單相體系中，以四正辛基溴化銨（TOAB）為相轉(zhuǎn)移劑，將三價金的化合物（氯金酸或氯金酸鈉）轉(zhuǎn)移到有機相中，以烷基硫醇為穩(wěn)定劑，NaBH4為還原劑，制備粒徑為18 nm的AuNPs；硫醇/金鹽的比例越大、加入還原劑速度越快，冷卻溶液可以制得尺寸更小和單分散性更好的粒子，進一步通過配體交換反應(yīng)改變AuNPs表面

7、的配體而實現(xiàn)其功能化；（3）聚合物保護法：通常以含有聚乙二醇、硫醇或硫醚基團的聚合物為配體，以NaBH4為還原劑，制備水溶性或具有疏水性的粒徑小于10 nm的AuNPs。聚合物穩(wěn)定劑決定納米粒子的溶解性；例如，文獻10，11 采用硫醚或硫醇修飾的聚合物配體（烷基硫醚終端修飾的聚甲基丙烯酸等）一步法合成了具有高分散性的粒徑小于5 nm的AuNPs，粒子的大小和分散性可以通過改變聚合物的結(jié)構(gòu)、濃度和配體上能與金屬結(jié)合的基團個數(shù)來控制，并且可以將粒徑為1.11.7 nm的無熒光納米粒子轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒饧{米粒子。物理法是利用各種技術(shù)將塊狀固體金分散為金納米粒子，包括真空沉積法、電分散法、激光消融法等12。物

8、理法容易控制AuNPs的形狀并能獲得圖案化的AuNPs的陣列，但通常需要特殊的設(shè)備和技術(shù)，制備過程較復(fù)雜。2.2 金納米粒子的穩(wěn)定性和功能化將不同的識別分子（如功能基團）修飾到AuNPs上，獲得功能化納米粒子（AuNPs探針），有助于拓寬AuNPs的應(yīng)用范圍，發(fā)展基于AuNPs的分析/檢測方法。已有很多文獻對金納米粒子的功能化及應(yīng)用進行了綜述15，13。在介質(zhì)中保持單分散性和穩(wěn)定性是AuNPs在實際應(yīng)用中的關(guān)鍵。因此，人們不斷尋找新型穩(wěn)定劑和修飾方法以提高AuNPs的分散性。這些方法將有助于改善方法選擇性和準(zhǔn)確度，其中最具代表性的方法1如圖1所示。在生物分析中可以應(yīng)用靜電吸附法、共價偶聯(lián)（Au

9、S共價結(jié)合等）法和特異性識別法（抗體-抗原，生物素-親和素，DNA雜交等）將生物分子修飾到AuNPs表面，合成AuNPs探針。圖1 金納米粒子探針合成示意圖1（略）Fig.1 Schematic representation of formation of gold nanoparticle probes1Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA and reproduced with permission.將配體通過靜電吸附作用固定在AuNPs表面的方法簡單、省時3，但是配體與AuNPs結(jié)合強度小，穩(wěn)定性差。如果反應(yīng)緩沖溶液中含有二硫蘇糖醇（

10、DDT，含有兩個巰基、不帶電的小分子，常用作蛋白保護劑）或在高鹽緩沖溶液（一般用于DNA雜化實驗）進行長時間的孵育時，表面不穩(wěn)定的AuNPs探針很容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而降低了檢測的選擇性。與靜電吸附法相比，共價偶聯(lián)的方法較復(fù)雜，需要進行更多的配體合成工作。但是，配體與AuNPs通過共價鍵結(jié)合穩(wěn)定性好。在共價偶聯(lián)中通常以Au-S共價結(jié)合獲得AuNPs探針，這種方法必須使用含有S的配體，如硫醇或二硫化物修飾的DNA、多肽CALNN等15，1315，通過共價法獲得的AuNPs探針可以承受很高的鹽濃度（2 mol/L NaCl）， 并在某種程度上可以抵抗二硫蘇糖醇或帶巰基或氨基的分子的攻擊。特別是

11、將具有雙親性的配體（有S端具有疏水性，另一端具有親水性，如烷基硫醇修飾的聚乙二醇、多肽CALNN等）通過共價鍵法修飾到AuNPs上，在其表面形成疏水-親水層，將極大提高AuNPs在水溶液中的穩(wěn)定性。利用某些生物分子之間的特異性識別，如，（1）鏈霉親和素修飾的AuNPs可以結(jié)合生物素化的蛋白（如免疫球蛋白和血清蛋白）或寡聚核苷酸16；（2）蛋白A修飾的AuNPs用于連結(jié)不同免疫球蛋白的Fc碎片17；（3）糖修飾的AuNPs用于識別其相應(yīng)的結(jié)合蛋白，也可以設(shè)計功能化的AuNPs探針。3 金納米粒子探針的應(yīng)用3.1 重金屬離子檢測基于AuNPs的比色法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于有毒重金屬離子（Pb2+，Cd2

12、+和Hg2+等）的檢測18，19，這種方法克服了傳統(tǒng)方法中諸如使用有機溶劑、光敏感的染料分子，實驗過程繁瑣以及儀器操作復(fù)雜等缺點。Wang等19研制出基于DNAzyme修飾的AuNPs比色傳感器，可以快速、簡單、實時及線性范圍可調(diào)地檢測Pb2+（見圖2）。他們選擇對Pb2+有高特異性識別的DNAzyme，DNAzyme由底物鏈和識別鏈組成。底物鏈5末端和識別鏈3末端分別連有8個互補堿基做為延長鏈，兩個互補堿基鏈可以使底物鏈和識別鏈在特定的溫度下穩(wěn)定雜交，同時也能夠保證在Pb2+存在時，后者將DNAzyme另一端分裂后釋放出單鏈DNA(ssDNA)。該體系在Tris和NaCl調(diào)節(jié)離子強度后加入A

13、uNPs，當(dāng)Pb2+存在時，Pb2+作用于DNAzyme的識別位點將ssDNA釋放出來并與AuNPs結(jié)合，阻止后者聚集，而使溶液呈現(xiàn)納米金單分散狀態(tài)的紅色。沒有Pb2+或有其它金屬離子存在時，不發(fā)生分裂反應(yīng)，加入的AuNPs無ssDNA保護而發(fā)生聚集，溶液變?yōu)樗{紫色。這種傳感器對Pb2+的檢出限為3 nmol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國環(huán)境保護局（EPA）對飲用水中Pb2+濃度的檢出限18，19。Li等20報道了另一種基于DNA修飾的AuNPs探針檢測Hg2+的比色方法，這種方法靈敏度更高，檢出限可達1 nmol/L。Xue21和Lee22等依據(jù)Hg2+可與胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T復(fù)合物，建立了一種

14、高靈敏性和高選擇性檢測Hg2+的方法，即在特定溫度下因Hg2+誘導(dǎo)DNA修飾的AuNPs聚集狀態(tài)的改變導(dǎo)致溶液顏色改變來檢測Hg2+。如果使用對其它金屬離子具有選擇性的堿基對取代胸腺嘧啶，可實現(xiàn)對其它金屬離子的檢測。圖2 （a）左圖：包含識別鏈17E(8)和底物鏈(8)17S的DNAzyme，右圖：非標(biāo)記的比色傳感器；（b）pH=7.2時，加入不同濃度的Pb2+后AuNPs溶液的顏色變化圖，線性范圍0.0031.0 mol/L；（c）pH=5.5時，加入不同濃度的Pb2+后，AuNPs溶液的顏色變化圖，線性范圍0.12020 mol/L 19（略）Fig.2 (a) Left：secondar

15、y structure of DNAzyme complex，which consists of an enzymestrand(17E(8) and a substrate strand(8)17S).Right：schematic of label-free colorimetric sensor.Color change of the gold nanoparticle(AuNP) solution with different concentrations of lead in the solution at pH 7.2(b) and 5.5(c)；the dynamic range

16、 of the assay is 3 nmol/L to 1 mol/L at pH 7.2 and 120 nmol/L to 20 mol/L at pH 5.5，respectively 19Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA and reproduced with permission3.2 小分子檢測將對特定小分子具有親和性的官能團修飾到AuNPs表面，可發(fā)展基于AuNPs的應(yīng)用于小分子檢測的比色法23。Ai等24基于分子識別原理，建立了原奶和嬰兒配方奶中三聚氰胺的檢測方法，無需借助任何儀器，1 min內(nèi)裸眼檢出限可達20 nm

17、ol/L。最近，發(fā)展基于適配子（通過體外篩選技術(shù)“指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX）”）修飾的AuNPs比色法并應(yīng)用于小分子（腺苷，可卡因等）檢測也引起了人們的廣泛關(guān)注25，26，如Wang等27用適配子修飾的AuNPs設(shè)計了一種“Preudo”夾心反應(yīng)，通過SPR光譜檢測小分子（腺苷）。3.3 DNA檢測DNA修飾的AuNPs與目標(biāo)DNA雜交后可以形成有序的聚集體，溶液顏色發(fā)生改變，從而實現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。已有大量文獻對基于AuNPs比色法檢測DNA及其在生物傳感器、疾病診斷、基因表達等方面的應(yīng)用進行了報道和綜述15。結(jié)合相應(yīng)的光/電分析方法，人們還發(fā)展了一系列新的基于DNA修飾

18、的AuNPs的檢測手段。Hill等28以DNA修飾的AuNPs為探針，將生物條形碼方法和微流體芯片技術(shù)相結(jié)合，建立了一種新的生物條形碼分析法（基因組的條形碼分析方法），快速、精確地檢測DNA。這種方法使用阻斷鏈抑制靶標(biāo)物再次雜交，可以檢測雙鏈基因組DNA（見圖3）。這項工作為生物條形碼方法從實驗室到實際應(yīng)用開辟了道路。Dai等29結(jié)合動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)，提出了基于AuNPs探針一步法高靈敏性檢測同源DNA的方法。該方法操作簡單且無需分離和信號放大步驟，檢出限約1 pmol/L，優(yōu)于其它光吸收法4個數(shù)量級，并可以很容易地區(qū)分單堿基對錯配DNAs和完全匹配的靶標(biāo)物DNAs。Zhang等30研

19、制出一種基于三明治結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核酸計時電量傳感器（CDS）。將一個單鏈DNA探針固定在金電極上，每個探針側(cè)面與一個或兩個靶序列的碎片相連，然后浸入含有目標(biāo)單鏈DNA分子的溶液中，此時電極上單鏈DNA探針與溶液中互補序列的目標(biāo)DNA單鏈分子雜交并用DNA修飾的AuNPs進行信號放大，用計時電位法觀察Ru(NH3)63+與單鏈DNA的靜電吸附情況（見圖4）。圖3 (a）基因組的條形碼分析方法示意圖28；（b）掃描芯片圖，檢出限為2.5 fmol/L；（c）5次平行實驗得出的掃描信號密度數(shù)據(jù)（略）Fig.3 (a) Schematic representation of Genomic Bio B

20、ar Code Assay.For details of the assay，readers are advised to see Ref.28；(b) Representative slide from a single assay showing that 2.5 fmol/L is distinguishable from the 0 fmol/L(no target) sample；(c) The data shown above are the average of 5 independent runs of the genomic DNA bio bar code assay28.

21、Copyright ACS and reproduced with permission圖4 CDS法檢測DNA示意圖（a）巰基修飾的單鏈DNA捕獲探針在金電極上自組裝；（b）單鏈DNA探針與溶液中互補序列的目標(biāo)DNA單鏈分子雜交，一個捕獲探針只能與一個目標(biāo)分子雜交；（c）DNA結(jié)合AuNPs放大檢測信號，AuNPs上成百上千的DNA探針可與目標(biāo)分子雜交30（略）Fig.4 Chronocoulometric DNA sensor(CDS) strategy for DNA detection.(a) Gold electrode self-assembled with thiolated c

22、apture probe DNA and spacer molecule，MCH.(b) DNA hybridization brings target DNA to the electrode surface.Of note，in the absence of amplification，one capture probe only captures one target molecule at the most.(c) AuNP-amplified DNA detection.One hybridization event brings an AuNP loaded with hundre

23、ds of reporter probes proximal to the electrode30Reproduced with permission from Nature Publishing Group（略）3.4 蛋白質(zhì)分析AuNPs與蛋白質(zhì)結(jié)合獲得用于電子顯微鏡的AuNPs探針，在電子顯微鏡甚至光學(xué)顯微鏡水平上對抗原、抗體進行定位、定性及定量研究，是AuNPs應(yīng)用于免疫細(xì)胞和組織化學(xué)的重要里程碑2，3，31，32。利用AuNPs的光學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)結(jié)合不同的檢測技術(shù)同樣可以檢測蛋白質(zhì)33，34。最近，Gupta等31設(shè)計了一種吸附可控的動力學(xué)模型，實現(xiàn)了對稀溶液中抗原的有效檢測。Amb

24、rosi等33合成了一種新的基于人抗IgG過氧化酶（HRP）修飾的雙編碼AuNPs（DC-AuNPs）探針，探針與抗體結(jié)合后增強了分光光度法和電化學(xué)法檢測人抗IgG信號，檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）33。依據(jù)相同的檢測原理，Cui等34設(shè)計了AuNPs/碳納米管（CNT）雜化平臺，用辣根過氧化酶修飾的AuNPs探針檢測人IgG。分子與AuNPs結(jié)合后可以增強拉曼信號，據(jù)此可以利用AuNPs作底物，通過基于表面增強拉曼效應(yīng)（SERS）的光譜分析法來快速檢測蛋白-蛋白之間相互作用3538。Manimaran等35用熒光素修飾的AuNPs結(jié)合人抗IgG檢測1100 mg/L 人IgG。Li等3638提出了基于SERS的芯片分析法檢測蛋白-抗體之間的相互作用，即將多肽結(jié)合到AuNPs上，然后銀染將信號放大，再用拉曼光譜進行檢測。基于適配子（Aptamer）修飾的AuNPs也可以用來檢測蛋白質(zhì)。Wang等39研制出基于Aptamer-AuNPs的比色傳感器，通過Aptamer和-凝血酶的反應(yīng)檢測-凝血酶，這種傳感器具有高靈敏性和高選擇性，可以檢測人血漿中的蛋白。酶的活性檢測和動力學(xué)參數(shù)分析是生物分析和生物醫(yī)學(xué)的一個重要課題。研究人員結(jié)合AuNPs的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)提出了許多新的檢測酶活性的方法4044。文獻14詳盡闡述了AuNPs探針用于分析蛋白激酶和蛋白磷