缺血后處理對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細胞凋亡及Bc

1、缺血后處理對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表達的影響劉晶晶1，趙硯麗1，（河北省人民醫(yī)院麻醉科，河北，石家莊，050051）Effect of ischemic postconditiong on apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax gene in renal tissue induced by ischemia-referfusion injury in ratsLIU Jing-jing, ZHAO Yan-li, Department of Anesthesiology, Peoples Hospital

2、 of Hebei Province,Shijiazhuang 050051, ChinaAbstract AIM To investigate the effect of ischemic postconditiong on apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax gene in renal tissue after transient ischemia-reperfusion (I/R) injury and its mechanism. METHODS Eighteen male SD rats weighing 250-280g we

3、re randomly allocated into 3 groups (n=6 each): group sham operation (S); group I/R and group I/R+ischemic postconditioning(IPo). The rats were anesthetized with intraperitoneal chloral hydrate 300 mg·kg-1. Bilateral kidneys were exposed through midline incision and bilateral renal pedicels wer

4、e occluded 45 min with atraumatic mini-clamp then unclamped for 6 h. In S group the kidneys were exposed but their pedicles were not clamped. In IPo group, 45 min ischemia was followed by three 10 s episodes of ischemia at 10 s intervals for reperfusion. The animals were killed at 6 h of reperfusion

5、. Blood samples were taken from heart for determination of urea nitrogen(BUN) and serum creatinine(Cr) uric acid(UA) concentrations. Kidneys were removed immediately for determination the expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA by RT-PCR and for microscopic examination. The apoptosis in the nephridial

6、 tissue was assessed using TUNEL and apoptotic index(AI) was calculated. RESULTS The Cr and BUN concentrations, the expression of Bax mRNA and the AI were significantly increased whereas the expression of Bcl-2 mRNA and the Bcl-2 mRNA/Bax mRNA ratio were significantly decreased in I/R group as compa

7、red with S group（P< 0.05）. Microscopic examination showed edema, degeneration and necrosis of ischemia renal tubule endothelial cell, tubular ectasia, congestion, edema and neutrophil of interstitial substance in I/R group The BUN and serum Cr levels, the expression of Bax mRNA and the apoptotic

8、index(AI) were significantly lower whereas the expression of Bcl-2 mRNA and the Bcl-2 mRNA/Bax mRNA ratio were significantly higer in IPo group than in I/R group（P< 0.05）. CONCLUSION Key words Ischemic；Kindey；Reperfusion injury； Apoptosis；Genes，Bcl-2 摘要 目的：觀察缺血后處理 (ischemic postconditioning , IPo

9、)對大鼠腎缺血再灌注(ischemia - reperfusion , I/ R)損傷后腎組織細胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表達的影響，并探討其腎保護的機制。方法： 18只雄性SD大鼠隨機分為3組（n6），假手術(shù)組（S組），缺血再灌注組（I/R組），缺血后處理組（IPo組）。采用夾閉雙側(cè)腎蒂45 min、再灌注6 h制備腎臟缺血再灌注模型。IPo組在夾閉雙側(cè)腎蒂45 min后，再灌注10 s，缺血10 s，反復3次，再全面恢復血液灌注。再灌注6 h時處死大鼠， 酶法測定血清肌酐（Cr）含量、苦味酸不除蛋白法測定尿素氮（BUN）含量，采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）法檢測腎組織Bcl-2

10、 mRNA和Bax mRNA表達，表達水平以與其相應的內(nèi)參actin的光密度比表示；原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記（TUNEL）法檢測腎組織中凋亡細胞，計算凋亡指數(shù)（apopatic index，AI）；蘇木素-伊紅（HE） 染色，在光鏡下觀察腎組織病理學變化。結(jié)果：與S組比較，I/R組腎組織Cr 和BUN濃度升高（P <0.05），Bcl-2 mRNA表達量降低（P <0.05），Bax mRNA表達量升高（P <0.05），Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值降低（P <0.05），凋亡指數(shù)（AI）增加（P <0.05），組織形態(tài)學觀察可見腎小管上皮細胞

11、水腫，變性壞死，腎小管擴張，間質(zhì)淤血、水腫、大量中性粒細胞浸潤。與I/R組相比， IPo組腎組織Cr 和BUN濃度降低（P <0.05），Bcl-2 mRNA表達量升高（P <0.05），Bax mRNA表達量降低（P <0.05），Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值升高（P <0.05），凋亡指數(shù)（AI）減少（P <0.05），腎組織形態(tài)學損傷減輕。結(jié)論：缺血后處理可減輕腎臟I/R損傷，其腎保護作用可能與其上調(diào)Bcl-2 基因和下調(diào)Bax基因的表達，使Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值升高，從而抑制缺血再灌注損傷后的腎組織細胞凋亡有關(guān)。關(guān)鍵詞缺

12、血；腎；再灌注損傷；細胞凋亡；基因，Bcl-2中圖號查閱中圖圖書館分類號第四版式 文獻標識碼A0 引言缺血后處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷1，2，在隨后的實驗中發(fā)現(xiàn)，IPo還可以減輕腦3、肝4及腸的缺血再灌注損傷。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)IPo可以抑制腎I/R損傷誘發(fā)的腎組織細胞凋亡，具有一定的腎保護作用，但是抑制凋亡的的具體機制有待探討。細胞凋亡是基因控制的細胞主動死亡過程。目前認為至少有兩類基因與凋亡調(diào)控有關(guān)，以Bcl-2為代表的抗凋亡基因和以Bax為代表的促凋亡基因共同調(diào)節(jié)細胞凋亡。本研究觀察IPo對大鼠腎I/R損傷后腎組織細胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表達的影響，并探討IPo腎保護的機制

13、1 材料和方法1.1 動物選擇及分組 健康雄性SD大鼠18只，體重250280 g ，由河北省實驗動物中心提供，隨機分為3組：假手術(shù)組（S組），缺血再灌注組（I/R組），缺血后處理組（IPo組），每組6只。1.2 模型制備 術(shù)前禁食12 h，自由飲水。大鼠腹腔注射10水合氯醛3 ml/kg麻醉后，將大鼠仰臥位四肢固定于鼠臺上，行腹正中切口，鈍性分離腎包膜，顯露和游離腎臟，仔細分離腎蒂，保護輸尿管，用無損傷動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，腎臟顏色變?yōu)榘导t色即可確認腎臟血流阻斷，造成雙側(cè)腎缺血45 min后，顯露腎臟，松開動脈夾,腎臟由暗紅色恢復鮮紅色即可確認血流恢復，逐層縫合腹部正中切口。再灌注6 h即為腎

14、缺血再灌注模型。夾閉和放開腎蒂時腹腔內(nèi)各注射林格液20 ml/ kg 。S組僅行開腹，游離出雙側(cè)腎臟，分離雙側(cè)腎蒂不夾閉，傷口用生理鹽水紗布覆蓋，暴露45 min不作腎缺血處理； IPo組夾閉雙側(cè)腎蒂45 min后，再灌注10 s，缺血10 s，反復3次，再全面恢復血液灌注6 h。1.3 標本制備 再灌注后6 h時,過量麻醉劑下經(jīng)心臟抽血迅速處死動物。將血液標本注入離心管，靜置30 min，2500 r/ min 離心15 min ,提取血清標本，70冰箱保存，待測。在無菌條件下，迅速摘取左腎，分裝入1.5 ml離心管，液氮凍存，用于進行PT-PCR。取右腎，4多聚甲醛固定，后依次進行脫水、透

15、明、浸蠟，制備石蠟切片，4保存待用。1.4 血清Cr、BUN含量的測定 應用Selectra-E全自動生化分析儀（Vital，荷蘭）酶法測定血清Cr水平，苦味酸不除蛋白法測定BUN含量。1.5 腎組織Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達的測定 取50100 mg標本勻漿后，Trizol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度計檢測法測定RNA含量，取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以-actin為內(nèi)參照，擴增Bcl-2、Bax和-actin，所有引物均由上海生物工程公司合成。引物序列和擴增產(chǎn)物長度，見表1。Bcl-2基因擴增條件為：變性94（5 min），然后擴增94

16、（45 s），52（30 s），72（45 s）（35個循環(huán)），延伸72（5 min）。Bax基因擴增條件為：變性94（5 min），然后擴增94（45 s），56（45 s），72（45 s）（35個循環(huán)），延伸72（5 min）。取RT-PCR產(chǎn)物4l，加上樣緩沖液1l，在1.5瓊脂糖凝膠上電泳，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)（美國UVP 公司）拍攝打印實驗結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）進行光密度測量，以每一目的基因與其相應的內(nèi)參actin的比值代表該樣品PCR產(chǎn)物的相對含量。1.6 腎組織病理學觀察和凋亡細胞的檢測 HE染色，在400倍光鏡

17、下觀察腎組織病理學改變。TUNEL法測定檢測腎組織中凋亡細胞（試劑盒購自德國Boehringer Mannhiem公司）按試劑盒說明書操作。光鏡下觀察凋亡細胞，細胞核呈棕黃色者為陽性細胞,于凋亡細胞分布區(qū)域，隨機選取5個視野, 用10×40 倍光鏡計數(shù)凋亡細胞，以腎小管上皮凋亡陽性細胞數(shù)占總腎小管細胞數(shù)的百分比作為腎小管細胞凋亡指數(shù)（apopatic index，AI），AI ()= 陽性細胞數(shù)/視野所有細胞總數(shù)×100。統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析, P&l

18、t;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 各組Cr 、BUN水平的變化 再灌注6 h時，與S組相比， I/R組和IPo組Cr 、BUN水平均明顯升高（P <0.05），與I/R組比較，再灌注6 h時，IPo組Cr 、BUN濃度降低（P <0.05），見表2。 2.2 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及其比值的變化 PCR所得的Bcl-2 、Bax和-actin條帶的大小與設計的一致（擴增目的片段長度Bcl-2 為702bp，Bax為407bp，-actin為375bp）。大鼠腎組織總RNA行PCR擴增的產(chǎn)物電泳條帶，Bcl-2 mRNA：S組電泳條帶最明顯， IPo組的

19、電泳條帶比較明亮，I/R組電泳條帶較淺，見圖1。Bax mRNA：S組電泳條帶淺暗，其次為IPo組的電泳條帶比較明亮，I/R組最明顯，見圖2。與S組相比，I/R組和IPo組Bcl-2 mRNA表達量降低，Bax mRNA表達量升高，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與I/R組比較，IPo組Bcl-2 mRNA表達量升高，Bax mRNA表達量降低，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。2.3 組織病理學結(jié)果 S組腎小球、腎小管未發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變,見圖3；I/R組部分腎小管上皮

20、細胞腫脹，出現(xiàn)水樣變性和空泡變性，腎小管擴張，內(nèi)可見管型和壞死脫落細胞，少量腎小管腔內(nèi)有蛋白性液體積聚，間質(zhì)充血水腫大量炎細胞浸潤，管周血管明顯擴張淤血,見圖4； IPo組腎小球輕度淤血,少量腎小管上皮細胞輕度水腫、空泡變性，罕見管型，間質(zhì)充血水腫有少量炎細胞浸潤管周稍有淤血，見圖5。2.4 腎小管上皮細胞凋亡的變化 S組偶見凋亡細胞，見圖6，I/R組和IPo組凋亡細胞數(shù)增加，見圖7，8。與S組相比，再灌注6 h時，I/R組和IPo組AI明顯增高（P<0.05）；但IPo組AI較I/R組下降（P<0.05），見表3。表1 RT-PCR反應檢測Bcl-2、Bax和-actin基因表達

21、的引物序列和擴增產(chǎn)物長度基因上游引物下游引物擴增產(chǎn)物（bp）Bcl-25-caagaatgaaagcacatcc -35-atcccagcctccgttatcc -3702Bax5-ggctggcaaggcctggt -35-agccacaaagatggtcactgtct -3407-actin5-gccatgtacgtagccatcca-35-gaaccgctcattgccgatag-3375表2 三組大鼠腎I/R損傷6h時腎功能的比較（n6，±s）組別Cr（mg/L）BUN（mmol/L）S組53±75.4±0.6I/R組110±10*21.2

22、77;2.2*IPo組76±9*# 11.7±1.6*#與S組比較，*P <0.05 與I/R組比較，#P <0.05表3 三組大鼠腎組織Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及其比值和凋亡指數(shù)的比較（n6，±s）組別Bcl-2 mRNABax mRNABcl-2 mRNA/ Bax mRNAAIS組0.91±0.060.58±0.031.574±0.0302.7±1.3I/R組0.65±0.04*0.74±0.05*0.872±0.051*28.4±5.9*IPo組0.7

23、7±0.05*#0.66±0.04*#1.172±0.025*#18.8±3.8*#與S組比較，*P <0.05 與I/R組比較，#P <0.053 討論本研究采用夾閉雙側(cè)腎蒂45 min再灌注6 h制備腎臟缺血再灌注損傷模型5。I/R組Cr、BUN濃度水平明顯升高，提示腎功能嚴重受損，腎組織形態(tài)學損傷嚴重。本實驗所采用的后處理的時間，次數(shù)是根據(jù)預實驗結(jié)果和參考文獻6,7確定的。TUNEL法是目前常用的分析細胞凋亡的研究手段，故本研究采用此方法探討腎小管上皮細胞凋亡程度。有研究表明，腎I/R損傷與腎組織細胞凋亡8及其調(diào)控基因Bcl-2和Bax

24、的表達密切相關(guān)9。Bcl-2可通過抑制自由基的產(chǎn)生及細胞內(nèi)鈣超載，抑制線立體膜的通透性、阻止細胞色素C的釋放及caspase的激活等機制發(fā)揮抑制凋亡的作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白能通過降低氧自由基活性和抑制氧自由基生成發(fā)揮抗氧化作用，Bcl-2蛋白還能維持線立體的氧化功能10。而Bax是促凋亡基因，能促進細胞因子缺失而誘導細胞凋亡，Bax與Bax可形成同源二聚體，兩者的比例決定細胞向存活還是凋亡方向發(fā)展促進細胞凋亡。本研究證明IPo可能通過上調(diào)腎小管上皮細胞Bcl-2和下調(diào)Bax，從而使Bcl-2/ Bax比值升高來發(fā)揮其抗氧化、增加膜穩(wěn)定性作用。本實驗結(jié)果顯示，雙側(cè)腎缺血45 min后

25、，采用再灌注10s，缺血10s，反復3次的間斷恢復腎血流灌注的IPo方法，可以改善腎功能，減輕病理學改變，降低凋亡指數(shù)，提示缺血后處理可以保護腎臟，減輕缺血再灌注損傷。本實驗所采用缺血再灌注前、反復短暫的預再灌注、停灌注的IPo 方案，在某種意義上相當于有控制的緩慢間歇性復氧，可減少突然復氧時氧自由基的爆發(fā)性產(chǎn)生，并刺激胞內(nèi)抗氧化酶和自由基清除劑的釋放而發(fā)揮保護效應。IPo發(fā)生在缺血后、再灌注前，面對的是已缺氧腎小管上皮細胞, 是從建立一種更合理、更有效的再灌注角度出發(fā), “處理”和挽救已缺血腎小管上皮細胞，最大限度地減輕再灌注損傷。而且IPo是在器官缺血后、恢復全面血流灌注前施之，方法簡單、

26、時間從容，因此可能更有直接的臨床實用價值11。綜上所述，IPo可減輕腎臟I/R損傷，其腎保護作用可能與其上調(diào)Bcl-2 基因和下調(diào)Bax基因的表達，使Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值升高，從而抑制缺血再灌注損傷后的腎組織細胞凋亡有關(guān)。參考文獻：1 Sato H, Jordan JE, Zhao ZQ, et al. Gradual reperfusion reduces infarct size and endothelial injury but augments neutrophil accumulation. Ann Thorac SurgJ, 1997, 64: 109911

27、07.2 陶凌, 李源, 高峰, 等. 缺血后處理對急性心肌缺血再灌注兔心臟的保護作用. 第四軍醫(yī)大學學報J，2000, 21: 116118.3 熊利澤, 楊靜, 徐寧, 等. 缺血后處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響. 中華麻醉學雜志J, 2005, 25: 508-510.4 孫凱, 劉志蘇, 孫權(quán). 缺血后處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用. 武漢大學學報(醫(yī)學版) J, 2004, 25: 104-107.5 陳聰聰, 柳子明, 王慧華, 等. 烏司他丁對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用. 中華麻醉學雜志J, 2004, 24: 828-832.6 Kin H, Zhao ZQ, Sun HY, et al. Postconditioning attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion. Cardiovasc ResJ, 2004, 62: 74-85.7 Heusch G,