熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌腹腔CEA水平及其臨床意義的研究

1、熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌腹腔CEA水平及其臨床意義的研究         【摘要】  目的：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌腹腔內(nèi)CEA水平并探討其臨床意義。方法：2003年5月至2004年3月，收集在日本愛知癌癥中心手術(shù)107例結(jié)直腸癌病例的腹腔沖洗液，每個(gè)樣本的cDNA應(yīng)用隨機(jī)引物合成，并在羅氏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（LightCycler）上進(jìn)行定量分析。每個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查。所有病例術(shù)后經(jīng)過平均為1年的隨訪。結(jié)果：CEA mRNA的陽性率和水平均與腫瘤的侵潤(rùn)度（T），分期以及淋巴結(jié)

2、轉(zhuǎn)移相關(guān)。在一個(gè)合理界定值上，CEA 和CK20檢測(cè)的敏感度與特異度均為100%和100%,而常規(guī)的細(xì)胞學(xué)檢查則為33%和100%。結(jié)論：CEA定量分析是檢測(cè)結(jié)直腸癌腹腔微轉(zhuǎn)移的敏感和特異的方法，CEA mRNA水平的異常與術(shù)后的無瘤生存率顯著相關(guān)。其臨床意義有待于更長(zhǎng)期的隨訪結(jié)果。 【關(guān)鍵詞】  結(jié)直腸癌 CEA 實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR   Abstract  Objective:The purpose of this study is to detect CEA level in peritoneal cavity of colorectal can

3、cer patients by quantitative Realtime RT PCR method and investigate its clinical significance. Methods: From May 2003 to Mar. 2004, peritoneal wash was obtained from 107 patients with colorectal cancer in Aichi cancer center.  cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by R

4、andom primers.  Quantification of CEA mRNA was performed on a LightCycler instrument (Roche) with hybridization probe. A part of each peritoneal wash was also examined by conventional cytology. All patients were followed up for a median period of at least 12 months. Results: Both CEA mRNA posit

5、ive rates and values were significantly correlated with depth of tumor invasion, tumor stage, lymph node status.  Sensitivity and specificity of CEA and CK20 realtime RTPCR with an appropriate cutoff value were 100%, 100%, and 100%, 100%, respectively, whereas those of conventional cytology wer

6、e 33%, and 100%, respectively. Conclusion: CEA mRNA quantifications is sensitive and specific method for detection of micrometastases in the peritoneal washes of colorectal cancer patients.  Abnormality of CEA mRNA level in peritoneal washes is correlated with disease free survival for colorect

7、al cancer patients. Further followup study is needed to demonstrate the clinical significance of CEA mRNA in peritoneal washes.   Key words   Colorectal carcinoma;CEA; Realtime RTPCR   結(jié)直腸癌為常見多發(fā)的消化道惡性腫瘤，隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的人群患病率有所上升，并有年輕化趨向。全國(guó)每年約有新發(fā)結(jié)直腸癌病例13萬。已經(jīng)躍居我國(guó)惡性

8、腫瘤死亡率的第四位。長(zhǎng)江下游與東南沿海的江蘇、浙江、上海、福建、臺(tái)灣和香港地區(qū)是結(jié)直腸癌高發(fā)區(qū)。浙江省腫瘤醫(yī)院資料顯示，近9年來收治率增加98%，平均每年增加10.9%。與90年代初相比，收治率則增加515%。   目前，結(jié)直腸癌患者盡管接受了以手術(shù)為主的根治術(shù)，但臨床上仍有50的結(jié)直腸癌患者死于術(shù)后的腫瘤局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移, 成為手術(shù)治療失敗的主要原因1,2。因此應(yīng)用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)、建立定量熒光RTPCR方法檢測(cè)結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物、術(shù)后轉(zhuǎn)移的早期診斷受到高度重視。癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）是分子量為180000的細(xì)胞表面糖蛋白，

9、是結(jié)直腸癌細(xì)胞去分化過程中表達(dá)的一個(gè)重要標(biāo)志，是最有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物之一。90的結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌有CEA的高表達(dá)。自1965年應(yīng)用于臨床以來已作為胃腸道腫瘤的診斷和判斷預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。CEAmRNA指標(biāo)可確定結(jié)腸癌及直腸癌是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）技術(shù)，檢測(cè)結(jié)直腸癌患者手術(shù)腹腔沖洗液中游離細(xì)胞的癌胚抗原(CEA)mRNA特異性標(biāo)志物，并檢測(cè)3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA為內(nèi)參因子。結(jié)合術(shù)后對(duì)患者隨訪，研究結(jié)果將正確診斷腫瘤侵潤(rùn)程度和復(fù)發(fā)可能性，對(duì)結(jié)直腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的早期診斷有重要意義。同時(shí)為腫瘤患者術(shù)后放療、化療方案確定提供參考依據(jù)，

10、以提高患者生活質(zhì)量和患者生存率。   1  病例和方法   1.1  細(xì)胞株:人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移表達(dá)CEA中分化腺癌細(xì)胞株，由日本愛知癌癥中心癌癥研究所腫瘤病理實(shí)驗(yàn)室建立，并培養(yǎng)于加入10%小牛血清（GIBCO BRL,Gaithersburg）,100 unit/mL青霉素和100 ug/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan）中。   1.2  病例收集:收集從2003年5月至2004年4月在愛知癌癥中心手術(shù)的107例結(jié)直腸癌病例，其中包括60例

11、結(jié)腸癌，45例直腸癌，以及2例結(jié)直腸雙發(fā)癌。病例分期根據(jù)2001版UICC分期：10例0期，21例I期，34例期，31例期，11例期。病理類型為：高分化腺癌 4例，中分化腺癌 89例，低分化腺癌8例，黏液腺癌4例，未分化癌1例。   1.3  腹腔沖洗液的收集和保存:手術(shù)開始進(jìn)腹后，立刻分別用100 mL生理鹽水沖洗盆底，和膈下，輕微攪拌后回收沖洗液。離心（1800 r/min，5 min），PBS重新沖洗游離細(xì)胞沉淀，溶解于Isogen溶液中(Nippon Gene, Tokyo, Japan)，-80度保存至使用。其中一部分沖洗液同時(shí)常規(guī)Papnicolaou

12、染色，以進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。   1.4  實(shí)時(shí)RTPCR檢測(cè)：應(yīng)用隨機(jī)引物和寡核苷酸引物檢測(cè)腹腔沖洗液游離細(xì)胞CEA mRNA,CK20 mRNA 和GAPDH mRNA，經(jīng)細(xì)胞總RNA提取cDNA合成實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR步驟。寡核苷酸引物為   CEA引物： 5AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT,5GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG;   熒光探針：5TGAAATGAAGAAACTACACCAGG,5CTGCTATATCAGAGCAACCCCAA   GAPDH引物：5TGAACGGG

13、AAGCTCACTGG,5TCCACCACCCTGTTGCTGTA   熒光探針： 5TCAACAGCGACACCCACTCCT,5CACCTTTGACGCTGGGGCT   PCR 的擴(kuò)增使用Roche的LightCycler擴(kuò)增儀，總反應(yīng)體積為10 ul包括：Taq DNA聚合酶，dNTP混合物和緩沖，(LightCycler DNA Master hybridization probes, Roche), 4.0 mM MgCl2, 0.25 uM引物D和E, 0.4 uM的探針，1 ul的模板cDNA,于Roche的毛細(xì)管中。95(10 秒)變性

14、，50 -55 (10 s)淬火，72 (10 s)延伸，共50次循環(huán)，每次試驗(yàn)包括6個(gè)外對(duì)照管，1個(gè)陰性對(duì)照管，和未知濃度患者樣品管。mRNA的定量可在LightCycler上與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照后由軟件自動(dòng)計(jì)算得出。   1.5  統(tǒng)計(jì)分析:根據(jù)腫瘤浸潤(rùn)深度T，腫瘤分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間CEA mRNA 值顯著性的差異。無瘤生存率用KaplanMeier方法計(jì)算。   1.6  術(shù)后隨訪：所有病例均入全日本結(jié)直腸癌病例庫并按照愛知癌癥中心術(shù)后隨訪程序隨訪，無失訪。隨訪截至日期到2005年12月31日。 

15、0; 2  結(jié)  果   2.1  常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查:所有107例病例均做常規(guī)術(shù)中脫落學(xué)檢查，只有2例（1.9%）診斷為陽性。   2.2  結(jié)直腸癌腹腔沖洗液中CEA水平:利用引物合成CEA mRNA在10個(gè)黏膜層和黏膜下層的早期癌中均未能檢出。 根據(jù)以往在愛知癌癥研究所的研究中，將界定值定在1.0。 大于1.0定為陽性，小于1.0定為陰性。從盆底和膈下收集的標(biāo)本只要有一處CEA mRNA值為陽性，該病例定為陽性。   應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 共檢測(cè)了107例腹腔沖洗液標(biāo)本，RTPCR陽性率為

16、22.4%（24/107）。在pTis1, pT2, pT3 和 pT4各組病例中，陽性率分別為0%, 0%, 26.8%（11/41），76.5%（13/17），(P0.05)，各組病例的平均值分別為：0，0，700.2, 1125.8。CEA mRNA平均值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系：CEA mRNA平均值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性病例中陽性率分別為7.7%（5/65），45.2%（19/42）(P0.05),平均值為65.03，1687.05(P0.01)。CEA mRNA與腫瘤分期關(guān)系：在1，2，3，4期各組病例中，陽性率分別為0%, 14.7%(5/34),32.2%(10/31)，81

17、.8%(9/11)，(P0.05)，各組病例的平均值分別為：0，124.32，776.36,1119.74(P0.01)。腹腔轉(zhuǎn)移陽性病例的CEA mRNA平均值（1196.90）顯著高于腹腔轉(zhuǎn)移陰性病例（36.32）(P0.01)。   5例有腹膜轉(zhuǎn)移陽性的病例在鏡下均診斷為pT3pT4，其中只有一例常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為陽性（敏感度為20%）。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果為陽性（敏感度為100%）。各種病理學(xué)因素，與CEA的關(guān)系見表1。表1  CEA和各種病理學(xué)因素關(guān)系   2.4  初步隨訪結(jié)果：隨訪時(shí)間平均為12個(gè)月（范圍為620個(gè)

18、月），共有6例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中包括腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移2例，肝轉(zhuǎn)移3例，肺轉(zhuǎn)移1例。其中5例患者為CEA陽性，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為26.3%（5/19）（剔除5例陽性對(duì)照）。其中有一例，手術(shù)時(shí)未發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移，但CEA和CK20均為陽性，3月后再手術(shù)行肝轉(zhuǎn)移在切除時(shí)，探查確認(rèn)腹膜轉(zhuǎn)移。CEA陽性患者與陰性患者相比較，無瘤生存率有顯著差異（P0.01）。   3  討  論   3.1  結(jié)直腸癌治療失敗的原因之一即是腹腔轉(zhuǎn)移。常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查一直以來作為腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)，是腫瘤TNM分期以外的又一腫瘤預(yù)后因素，但Wind等報(bào)道，常規(guī)細(xì)

19、胞學(xué)檢查并不能為結(jié)直腸癌提供預(yù)后信息。腫瘤在進(jìn)行根治手術(shù)后病例仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)，原因通常被認(rèn)為是手術(shù)時(shí)腹腔內(nèi)即已存在從腫瘤漿膜面脫落的癌細(xì)胞，而這些脫落細(xì)胞通過常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查未被發(fā)現(xiàn)。本研究中，5例陽性對(duì)照病例（腹膜轉(zhuǎn)移）病理學(xué)診斷為pT3, 其中只有一例常規(guī)細(xì)胞學(xué)為陽性，敏感度為20%，提示建立一種新型的能檢出腫瘤微小轉(zhuǎn)移，具備高度敏感和特異方法的必要性。以往有利用常規(guī)RTPCR方法來檢測(cè)脫落癌細(xì)胞，Aoki等報(bào)道（2002）以CEA為標(biāo)記物應(yīng)用常規(guī)RTPCR方法來檢測(cè)脫落癌細(xì)胞，結(jié)果提示RTPCR的結(jié)果與腫瘤的浸潤(rùn)深度有關(guān)。但常規(guī)RTPCR方法有以下缺點(diǎn)：（1）它是定性而不是定量的方法，因而缺少

20、對(duì)于腹膜轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的定量預(yù)測(cè)。（2）基因擴(kuò)增和隨后的分析時(shí)間長(zhǎng)，難以馬上獲得結(jié)果。（3）有一定的假陽性的發(fā)生率。文獻(xiàn)報(bào)道CEA為(033%)69。而熒光定量RTPCR方法具有時(shí)間短（小于3小時(shí)），能在手術(shù)結(jié)束之前完成。具有高度敏感性，能夠檢測(cè)出107個(gè)正常細(xì)胞中的個(gè)數(shù)級(jí)別腫瘤細(xì)胞，不但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的檢驗(yàn)方法，而且敏感性優(yōu)于常規(guī)RTPCR3,10。而CEA是檢測(cè)脫落癌細(xì)胞的特異性腫瘤標(biāo)記物，因而通過檢測(cè)CEA水平能夠有效的監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌腹腔的微轉(zhuǎn)移。熒光定量RTPCR技術(shù)有帶來假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。通過設(shè)定合理界值（本研究CEA為1.0），能夠?qū)⒓訇栃院图訇幮钥刂圃谳^低水平。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在C

21、EA為標(biāo)記物結(jié)果中，敏感度和特異度分別為100%，100%。            是否要對(duì)CEA mRNA 的值進(jìn)行標(biāo)化，然后再比較，一直都有爭(zhēng)論。為了標(biāo)化CEA mRNA 的值，我們采用GAPDH mRNA定量測(cè)定來作為內(nèi)對(duì)照，因?yàn)樗从沉烁骨粌?nèi)脫落細(xì)胞的數(shù)量，并且與腫瘤的浸潤(rùn)深度無關(guān)。CEA:GAPDH 比值，與CEA的值一樣，都與腫瘤的浸潤(rùn)深度顯著相關(guān)，所以不必對(duì)CEA的值比照GAPDH值進(jìn)行標(biāo)化。這與之前在胃癌腹腔微轉(zhuǎn)移研究中得到的結(jié)果是一致的。   3.2

22、0; 本研究的結(jié)果顯示，通過引物合成CEA的陽性率以及數(shù)值，都與腫瘤的浸潤(rùn)深度pT顯著相關(guān)(P0.01),同時(shí)也于腫瘤的期別呈顯著相關(guān)（P0.01）。腫瘤的浸潤(rùn)程度越深，CEA的陽性檢出率就越高。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，腹腔沖洗液中CEA的水平，也與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P0.01),以及腫瘤的肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P0.01）。這與之前Nakanishi等1114在胃癌中的結(jié)果是一致的。提示隨著腫瘤生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞一方面外浸，另一方面則出現(xiàn)較高幾率淋巴轉(zhuǎn)移。而Aoki等報(bào)道的采用常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，CEA與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)不一致。以往結(jié)直腸癌病例通過淋巴結(jié)進(jìn)而導(dǎo)致腹膜播散的未見文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)的5名腹膜

23、轉(zhuǎn)移陽性對(duì)照患者，腫瘤為pT3但區(qū)域淋巴結(jié)都伴廣泛轉(zhuǎn)移，并證實(shí)周圍已經(jīng)有腹膜播散。說明腫瘤細(xì)胞通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)而導(dǎo)致腹膜播散的可能性仍存在。   3.3  近年來對(duì)于腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念發(fā)生了改變，分為兩大類：孤立性腫瘤細(xì)胞（Isolate tumour cells，ITC）,定義為單個(gè)，多個(gè)孤立性細(xì)胞或成簇腫瘤細(xì)胞，但直徑小于0.2 mm。腫瘤微轉(zhuǎn)移（Mircometastases）: 直徑大于0.2mm腫瘤細(xì)胞團(tuán)。ITC并不表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)上的轉(zhuǎn)移如穿透血管，淋巴竇，腫瘤細(xì)胞的增生以及基質(zhì)反應(yīng)。結(jié)局有可能發(fā)展成轉(zhuǎn)移，也有可能被機(jī)體免疫所消滅1517。而熒光定量PCR能

24、夠靈敏的檢測(cè)出ITC。Nakanishi等11報(bào)道胃癌腹腔沖洗液中CEAmRNA水平是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素（總生存率，以及腹膜無復(fù)發(fā)生存率）。本研究的隨訪結(jié)果也看到如此傾向，手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病例6例中有5例，其CEA的水平在第一次手術(shù)時(shí)為陽性，提示腹腔沖洗液中CEA的水平異常是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高危因素，與術(shù)后無瘤生存率密切相關(guān)，并有顯著性差異。是否是結(jié)直腸癌獨(dú)立預(yù)后因素，有待于更長(zhǎng)期隨訪結(jié)果的獲得后進(jìn)行分析。   檢測(cè)腫瘤ITC的作用不限于此，也為腫瘤的治療提供了一個(gè)新的思路。Kurebayashi等18在乳腺癌的動(dòng)物模型，Chaudhuri等19在卵巢癌的動(dòng)物模型，均證實(shí)

25、微轉(zhuǎn)移灶對(duì)于化療的敏感性較大轉(zhuǎn)移灶高，而Nakanishi等20在胃癌的腹腔轉(zhuǎn)移裸鼠模型中證實(shí):通過口服化療制劑(TS1)后，微轉(zhuǎn)移灶可完全緩解甚至治愈，生存率高于腹腔大轉(zhuǎn)移灶裸鼠。這就為臨床治療結(jié)直腸癌提供了一個(gè)新的策略，即分子水平的診斷（CEA的水平）以及隨后的對(duì)于具有高危因素患者的輔助化療。近年來隨著新的化療制劑的應(yīng)用于結(jié)直腸癌術(shù)后的輔助化療，結(jié)直腸癌的生存率有了一定程度的提高。能否將此技術(shù)與結(jié)直腸癌輔助化療結(jié)合起來，有待于今后進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】  1Safi F,Beyer HG.The value of followup of curative surgery of

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