紅色熒光蛋白(RFP)的原核表達

1、分子生物學綜合實驗 紅色熒光蛋白（RFP）的原核表達 報告題目 紅色熒光蛋白（RFP）的原核表達作者姓名饒慧班級學號0802班/2008114010214指導教師王友如完成時間2011年02月生物學實驗教學中心目 錄 引言11 實驗材料及實驗儀器41.1實驗材料41.2實驗儀器52 實驗方法72.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建72.2工程菌株的活化72.3誘導表達82.4 SDS-PAGE檢測表達蛋白83 結(jié)果與分析9總結(jié)10參考文獻11致謝13 紅色熒光蛋白的原核表達 饒慧（指導老師：王友如）（湖北師范學院生命科學學院 生物科學0802班 湖北 黃石 435002）摘 要 實驗?zāi)康模貉芯考t色熒光蛋白（R

2、ed Fluorescent Protein，RFP）基因在大腸桿菌中原核表達。 實驗方法：通過分別將DH-5(pDsRed-N1)和DH-5 (pET-28)提取質(zhì)粒、酶切并連接形成重組質(zhì)粒pET-28a-RFP，將重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化的方法把含紅色熒光蛋白（RFP）外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)進行表達，再用IPTG誘導RFP基因表達，可以看到顯現(xiàn)紅色，最后根據(jù)SDS-PAGE電泳結(jié)果，判斷RFP基因在大腸桿菌中是否成功表達。 實驗結(jié)果：結(jié)果顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28-RFP在E.coli中成功表達。關(guān)鍵詞 紅色熒光蛋白；質(zhì)粒重組；原核表達；誘導表達 Prokaryote Expression

3、of Red Fluorescent Protein (RFP) Rao Hui (Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi, Hubei,435002 ) Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5 (pDsRed-N1) and DH-5 (pET-28). Then the two plasmids

4、 are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judgi

5、ng whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induce

6、d Expression分子生物學綜合實驗 紅色熒光蛋白的原核表達 饒慧（指導老師：王友如）（湖北師范學院生命科學學院 生物科學0802班 湖北 黃石 435002）引言 基因標記技術(shù)是近年來發(fā)展起來的分子生物學技術(shù)。熒光蛋白基因在標記基因方面由于具有獨特的優(yōu)點而引起了科學家的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已被普遍應(yīng)用到分子生物學研究的各個方面。熒光蛋白是海洋生物體內(nèi)的一類發(fā)光蛋白，分為綠色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白1。熒光蛋白在某種定義下可以說是革新了生物學研究運用熒光蛋白可以觀測到細胞的活動，可以標記表達蛋白，可以進行深入的蛋白質(zhì)組學實驗等等。特別是在癌癥研究的過程中，由于熒光蛋白的

7、出現(xiàn)使得科學家們能夠觀測到腫瘤細胞的具體活動，比如腫瘤細胞的成長、入侵、轉(zhuǎn)移和新生。1999年，Matz 等2從印度洋太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離出6 種與綠色熒光蛋白(green fluorescentproteins ,GFP) 同源的熒光蛋白,并鑒定了它們的光譜性質(zhì)。紅色熒光蛋白(Red Fluorecent Protein,RFP)基因是從?？鸇iscoso-masp中分離出的一種新的熒光蛋白基因,其蛋白質(zhì)的最大吸收光譜為583 nm，不需要任何預處理便可檢測到3。紅色熒光蛋白因其紅熒光較強的組織穿透力，已被廣泛用于動物、植物和酵母等真核細胞內(nèi)基因表達的報告基因，但作為原核細胞表達的報告基

8、因還鮮有報道4。 自1999 年紅色熒光被發(fā)現(xiàn)后,引起了科學家廣泛的興趣,人們對其理化性質(zhì)和發(fā)光機制進行了深入的研究；通過對其修飾,人們得到了聚集程度低、成熟速率更快、發(fā)光強度更強和發(fā)射波長更長的突變株5。許多紅色熒光蛋白已經(jīng)具備了優(yōu)良的性質(zhì)，并廣泛應(yīng)用于生命科學研究.。但即使是性能優(yōu)良的紅色熒光蛋白，仍然有較大的定向改造余地。 例如，發(fā)展高亮度、遠紅外發(fā)射的單體熒光蛋白，將在深部組織成像方面有重要意義6。PCR技術(shù)是Kary Mullis在1985年建立起來的在細胞體外合成DNA的一種方法。依DNA半保留復制原理，利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，在附加的兩個引物與模板雜交之后，按堿基

9、配對原則經(jīng)酶促反應(yīng)合成DNA片段，包括模板變性、引物退火及用DNA聚合酶延伸兩個引物之間DNA的一定次數(shù)的重復循環(huán)，使包括在兩個引物5'端限定的特異性片段形成指數(shù)式積累。整個過程操作簡單，可在短時間內(nèi)在小管中獲得大量的特意的DNA拷貝，這一特點使PCR技術(shù)很快被應(yīng)用到了分子生物研究的廣大領(lǐng)域7。大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點8。而且其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌中蛋白量的30%，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表

10、達系統(tǒng)9。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達系統(tǒng),大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作,以及有大量可供選擇的克隆或表達載體,使之成為人們克隆表達外源基因的主要菌株10。 隨著人們對原核和真核生物基因調(diào)控的了解，通過綜合控制基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及向胞外分泌等諸多方面的因素，構(gòu)建出了多種具有不同特點的表達載體和工程菌株，以滿足表達不同性質(zhì)、要求的目的基因的需要。在原核細胞中表達蛋白質(zhì)的載體常用啟動子有T7啟動子、Trp啟動子-色氨酸啟動子、Tac啟動子、T7噬菌體中基因10的啟動子及Lac啟動子等。Lac啟動子受分解代謝系統(tǒng)活化蛋白和cAMP的正調(diào)控和阻遏物的負調(diào)控，當加入乳糖或某些類

11、似物IPTG可與阻遏蛋白形成復合物，使阻遏蛋白構(gòu)型改變，阻遏蛋白不再能與操縱基因結(jié)合，從而使結(jié)構(gòu)基因表達。根據(jù)原核生物基因表達特點選著載體進行目的基因克隆，然后轉(zhuǎn)入相應(yīng)的菌種中表達目的蛋白質(zhì)11。蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。當溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)帶負電荷，在電場中向正極移動；反之則向負極移動，這種帶電的顆粒在電場中泳動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。不同的蛋白質(zhì)由于等電點不同，在電場中的泳動速率也不同，因此應(yīng)用電泳技術(shù)很容易實現(xiàn)對蛋白樣本的分離與分析。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecy

12、l sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）是目前用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量的常規(guī)方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N'-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑（過硫酸銨）和增速劑（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）的氧化-還原作用下聚合而成的。凝膠的有效孔徑與它的總濃度T成反變關(guān)系，在高濃度時，凝膠孔徑小，可以篩分分子量小的多肽；低濃度時，凝膠孔徑大，則可篩分大分子蛋白質(zhì)。工作時，凝膠由濃縮膠和分離膠兩部分組成，濃縮膠濃度低、孔徑大，較稀的樣品經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用可被濃縮至一極窄的區(qū)帶，以提高樣品中各組分

13、在分離膠中的分辨率。SDS是一種陰離子去污劑，能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊。還原劑二硫蘇糖醇 (dithiothreitol, DTT）或巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，在樣本中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子將被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合,可形成帶負電荷的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，這就消除了不同蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異；然而，蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束的長軸長度與亞基分子量的大小成正比。因此，當這種膠束在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，遷移率不再受蛋白質(zhì)分子原有電荷的影響，而主要取決于蛋白

14、質(zhì)亞基分子量的大小。當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15 KD到200 KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)SDS-PAGE常用于蛋白質(zhì)分子量的測定，蛋白質(zhì)純度的分析，蛋白質(zhì)濃度的檢測，免疫印跡（Western Blot）的第一步，蛋白質(zhì)修飾及免疫沉淀蛋白的鑒定等12。 研究紅色熒光蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的原核表達。通過質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET-28a-RFP，將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌體內(nèi)，并用IPTG誘導其在大腸桿菌體內(nèi)進行表達，最后用SDS-PAGE檢測是否誘導表達成功。根據(jù)電泳結(jié)果得出結(jié)論，重組質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功誘導表達。1 實驗材料及實驗儀器 1.1實驗材料E.coli D

15、H-5(pDsRed-N1)和 E.coli DH-5(pET-28)菌株（由本實驗室保存）；溴酚藍；TEMED；IPTG(1 mM)；標準蛋白；SDS 10%(W/V)；LB液體培養(yǎng)基；卡那霉素100 mg/mL； 過硫酸銨10 mL10%(W/V) (現(xiàn)配現(xiàn)用）； Tris·HCl（pH 6.8）8× ：在40 mL水中溶解6.05 g Tris堿（0.5 mol/L），用1 mol/L HCl調(diào)校至pH 6.8，補加水至整體積100 mL，用0.45 um濾膜過濾，再加入0.4 g SDS 0.4%(m/V) 溶解后于4°C保存； 30%凝膠貯備液丙烯酰胺

16、29%（W/V）N,N'-亞甲基-雙丙烯酰胺1% （W/V） 15 %的分離膠雙蒸水4.7 mL1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）5.0 mL10 % SDS200 uL30 %丙烯酰胺溶液10 mLTEMED10 uL10 % 過硫酸銨100 uL總體積 20 mL 混勻后加入電泳槽的玻璃板夾縫中，并在膠面上加入約2 mL雙蒸水，1 h 后等膠自然凝聚，去凈雙蒸水，并在夾縫中放入梳子； 5%的濃縮膠 雙蒸水 5.8 mL 0.5 mol/L Tris·HCl （pH6.8） 2.5 mL 10 % SDS 100 uL 30 % 丙烯酰胺溶液 1.

17、6 mL TEMED 10 uL 10 % 過硫酸銨 50 uL 總體積 10 mL 混勻后加入夾縫中并沒過梳孔，待凝聚后小心拔出梳子，用電泳緩沖液沖洗加樣孔，清除未凝聚的丙烯酰胺；Tricine樣品緩沖液（2×）Tris·HCl/SDS pH 6.8（0.08 mol/L）2 mL甘油24 %（V/V）(3.0 g)2.4 mLSDS 8 % (m/V)0.8 gDTT（0.2 mol/L）0.31 g考馬斯亮藍G-250 0.02 % (m/V)2 mg 總體積 10 mL 固定液： 甲醇：水：乙酸（30:10:60） （V/V/V）； 脫色液： 甲醇：水：冰醋酸（4.

18、5:4.5:1） （V/V/V）； 染色液： 0.25 g考馬斯亮藍(R250)溶解于100 mL脫色液。 1.2實驗儀器1. BCM-1000生物潔凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司2. THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器 太倉市實驗設(shè)備廠3. DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠4. TGL-16C臺式離心機 上海安亭科學儀器廠5. HJ-3控溫磁力攪拌器 江蘇金壇市金南儀器廠6. 雷磁PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司7. AB204-N 電子天平 Mettler-Toleda Group8. KDM型調(diào)溫電熱套 武漢精華科教儀器有限公司2 實驗方法 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖1重

19、組質(zhì)粒pET-28a-RFP的構(gòu)建流程Fig. The formed technological process of pET-28-RFP recombined plasmid2.2工程菌株的活化 將卡那霉素100 mg/mL以1:1000 的比例加入LB液體培養(yǎng)基中，再將LB液體培養(yǎng)基取2 mL分裝至無菌紅帽試管中。 取活化的工程菌株10 uL于紅帽試管中。°C條件下180 rpm過夜培養(yǎng)。(注意問題：所有操作均在無菌條件下進行,注意超凈工作臺的操作步驟及注意問題。)2.3誘導表達 將過夜培養(yǎng)物按照1:100的比例加入至含卡那霉素的培養(yǎng)基中，37 °C條件下180 rp

20、m培養(yǎng)2-4 h至對數(shù)期。 將IPTG(1 mM)按照1:1000的比例加入至培養(yǎng)基中，每隔2 h觀察培養(yǎng)基的顏色變化。設(shè)置一個對照（不加入IPTG）。(注意問題: 所有操作均在無菌條件下進行。)2.4 SDS-PAGE檢測表達蛋白 配制15 % 的分離膠 配制5 % 的濃縮膠 樣品制備取菌液10000 r/min 離心2 min，棄上清，沉淀與2×上樣緩沖液1:1混勻，在沸水中水浴3-5 min，取出，10000 r/min 離心2 min，上清液即為樣品。 上樣與電泳將樣品及標準蛋白加入點樣孔后，接通電源，恒壓電泳至溴酚藍到離底部約3 cm時，停止電泳。 染色與脫色 將分離膠從玻

21、璃板上取下，在染色液中染色1-2 h后，在脫色液中過夜脫色，換保存液保存。 拍照保存3 結(jié)果與分析 圖2 蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果Lane 1： Marker protein；Lane 2：含質(zhì)粒pET-28-RFP的菌液總蛋白質(zhì)樣品（陽性對照）；Lane 3：含空載質(zhì)粒pET-28-RFP的菌液總蛋白質(zhì)樣品（陰性對照）。Fig. 2 the results of the protein electrophoresisLane 1: Marker protein; Lane 2:The total protein samples in bacterium fluid containing pET-28

22、-RFP plasmid (positive contrast); Lane 3: total protein samples in bacterium fluid containing un-loaded pET-28-RFP plasmid (negative contrast).（1）用IPTG誘導表達后試管內(nèi)菌液呈現(xiàn)紅色，說明含外源基因RFP的質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功表達。（2）由圖2可以看出，陽性對照比陰性對照多了一條帶，即為表達的目的基因（約44 KDa）。說明了陽性對照中質(zhì)粒重組成功，并成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)和在其體內(nèi)成功誘導表達；陰性對照重組質(zhì)粒未成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)不含目的基因，

23、故加入IPTG后未能顯現(xiàn)紅色，且電泳后比陽性對照少了一條帶?？偨Y(jié)本實驗是一個綜合性實驗，與我們平時的實驗相比對我們的要求更多更嚴。它主要要求我們形成認真思考的習慣，自己查閱本實驗的相關(guān)文獻，分析本實驗的目的，通過本實驗要達到什么樣的結(jié)果，達到預計的結(jié)果需要通過怎樣的方案實現(xiàn)，根據(jù)實驗需要和自己的相關(guān)了解自己設(shè)置適合的實驗方案，增強我們的思維能力和動手能力，同時也使我們的團隊合作精神得到了提高，并學會把我們所學的知識有機的結(jié)合到一起。跟我們平時的實驗相比較我們的實驗素養(yǎng)可以得到很大的提高，有利于我們今后的學習和研究。通過本次實驗我深刻的認識到了，在我們做研究的過程中一定要認真，每一步都不能出錯，

24、否則將功虧一簣，從頭開始。在實驗的過程中，制膠的過程出現(xiàn)了一些問題，使得凝膠不能聚合，分析原因可能有：(1)試劑質(zhì)量差，應(yīng)使用電泳級別的試劑 (2)過硫酸銨和TEMED的量不夠或失活，可增加劑量或重配新鮮的儲存液 (3)凝膠聚合時溫度太低，應(yīng)以室溫為宜。在實驗的過程中我們還應(yīng)該注意的有：1上樣時，樣品不能沉到加樣孔底部，可能是上樣緩沖液中甘油含量不足；或是加樣孔底部留有聚合的丙烯酰胺。2經(jīng)過煮沸的樣品雖然可以在-20保存數(shù)周，但若反復凍融會導致蛋白質(zhì)的降解。從-20取出的樣本，上樣前應(yīng)先升至室溫，確保SDS沉淀溶解。3注意避免電泳條帶彎曲畸變：(1)“微笑” 現(xiàn)象，可能是因為凝膠中間部分溫度過

25、高，降低電壓便可得到改善 (2)“皺眉”現(xiàn)象，常常是因為凝膠底部有氣泡或聚合不均勻 (3)“拖尾”、“紋理”現(xiàn)象，則多為樣品溶解不佳，增加蛋白樣品的溶解度并離心除去不溶性顆粒即可克服 (4)“暈輪”效應(yīng)（holo effect）多為加樣過量所致。4非特異性的染色主要是由于未溶解的染料的沉積而成，應(yīng)將染料溶液過濾后再用。參考文獻1 賈艷華，李國勛，張杰 熒光蛋白及其應(yīng)用 2 Matz MV , Fradkov AF , Labas YA , et al . Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species J . Nat B

26、iotechnol , 1999 , 17(10) :969 - 973. 3 龍華，尾里，建二郎，若松佑子，松島良次 紅色熒光蛋白（RFP）基因在轉(zhuǎn)基因青鳉中的表達，中國青年農(nóng)業(yè)科學學術(shù)報 20024 邢萬金，趙宇航，任仕超，包曉紅 紅色熒光蛋白DsRed2基因在大腸桿菌中的表達和觀察及其在本科實驗教學中的應(yīng)用  內(nèi)蒙古大學學報(自然科學版) , Journal of Inner Mongolia University，2008年05期5 郝麗梅，李唐棣，梅興國 紅色熒光蛋白的研究進展，國外醫(yī)學藥學分冊，2006年4月，第33卷第2期6 樊晉宇，崔宗強，張先恩 紅色熒光蛋白的光譜多

27、樣性及體外分子進化，Progress in Biochemistry and Biophysics 2008, 35(10): 1112-1120 7 魏春紅，李毅主編 聚合酶鏈反應(yīng)-PCR 現(xiàn)代分子生物學技術(shù) 高等教育出版社，2006.7:45-468 Nuc P. Nuc K. Recombinant protein production in Escherichia coliJ.Postepy Biochem,2006,52 (4):448-456.9 Dong X,Tang B,Li J,et al.Expression and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli J.J