聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合TaqⅠ酶切分析檢測(cè)到一例凝血因子Ⅷ基因熱點(diǎn)突變

1、    聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合Taq 酶切分析 檢測(cè)到一例凝血因子基因熱點(diǎn)突變          我們介紹運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合限制性內(nèi)切酶Taq 酶切分析方法研究凝血因子(F)基因熱點(diǎn)突變，首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)1例血友病A基因熱點(diǎn)突變，現(xiàn)報(bào)道如下。病例和方法1 病例資料 患者，男，3歲。平時(shí)有鼻衄、撞后出血不止等癥狀。1年前因唇外傷后出血不止來我院診治。家族中無類似病病史。主要實(shí)驗(yàn)室檢查：CT 10分鐘，BT 6.5分鐘，KPTT 93.2秒，F(xiàn)C

2、 2%(一期法)，F(xiàn)Ag?%(放免法)。2 基因組DNA抽提  按本室常規(guī)抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA。3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)3.1 引物：用于PCR擴(kuò)增F基因24號(hào)外顯子的引物序列為：pA7:5-TTGAGGTTGCAGCATGCCAT-3pA8:5-CTGAGGTCTCCAGGCATTAC-3以上引物由法國巴黎Bicetre醫(yī)院Meyer教授惠贈(zèng)。3.2 PCR：反應(yīng)體積50l，DNA 0.5g，引物各25 pmol，dNTP 50mol/L，1.5mmol/L MgCl,10mmol/L Tris-Cl(pH 8.3), 50mmol/L KCl, 0.1% Triton

3、X-100, Taq DNA聚合酶1.5U(Sangon公司產(chǎn)品)。擴(kuò)增條件：94預(yù)變性5分鐘，94變性30秒，56退火30秒，74延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后74延伸7分鐘。取10l上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作1.5%瓊脂糖電泳，檢查是否擴(kuò)增出特異性條帶。3.3 PCR產(chǎn)物酶切分析：見文獻(xiàn)1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)氯仿-異戊醇(241)抽提，取20l以限制性內(nèi)切酶Taq (Boehringer-Mannheim公司)10U，65酶切過夜。酶切產(chǎn)物作8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，1×TBE，電壓120V，電泳3小時(shí)。電泳后置0.5%溴乙錠染色30分鐘，置紫外燈下觀察酶切譜。4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)

4、物的克隆  PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)補(bǔ)平、磷酸化，1.2%瓊脂糖電泳純化后，與克隆載體pUC18(經(jīng)Sma酶切)在T DNA連接酶作用下連接，連接物常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，并在涂有X-gal和IPTG的LB平皿中接種，挑取白色菌落擴(kuò)增，抽取質(zhì)粒DNA，然后由EcoR、Hind 雙酶切鑒定。5 DNA序列分析 采用Sanger雙脫氧鏈終止法，按T Squencing試劑盒使用說明操作，-P dATP標(biāo)記，6%變性聚丙烯酰胺凝膠，厚度為0.4mm，膠長50cm，電泳在Pharmacia LKB公司的Macrophor測(cè)序儀上進(jìn)行，電壓1500V，時(shí)間36小時(shí)。測(cè)序膠置X線片曝光，室溫過夜，放射自

5、顯影。結(jié)果1 血友病A F基因外顯子24 Taq 酶切分析結(jié)果2 患者F基因第24號(hào)外顯子DNA序列分析結(jié)果，發(fā)生了CT點(diǎn)突變討論F基因DNA鏈上胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T)，形成一個(gè)終止密碼子(TGA)，使F肽鏈合成提前終止，合成較短的沒有功能的F。這通常與血友病A重型表型相關(guān)2。這種突變發(fā)生于CG雙核苷酸。CT突變是基因突變的“熱點(diǎn)”，其原理是胞嘧啶甲基化形成的5-甲基胞嘧啶自動(dòng)經(jīng)過脫氨作用形成胸腺嘧啶，結(jié)果引起DNA堿基CT突變。由于F基因及其cDNA較長，血友病A的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。在已發(fā)現(xiàn)的300多種基因缺陷中，點(diǎn)突變占174個(gè)(57%)，尤其是輕、中型患者，點(diǎn)突變是主要的發(fā)病機(jī)

6、制，其中熱點(diǎn)突變占25%3。在F cDNA中，共有7個(gè)Taq酶切位點(diǎn)，其中5個(gè)為CGA密碼子編碼精氨酸(Arg)。如果發(fā)生CT突變，即導(dǎo)致終止密碼子的產(chǎn)生，它們分別位于外顯子18，22，23，24和26號(hào)。最初血友病A患者的基因突變就是利用Southern印跡技術(shù)結(jié)合Taq 酶切發(fā)現(xiàn)的。為此我們應(yīng)用PCR結(jié)合Taq 酶切分析了72個(gè)血友病A病例F基因這5個(gè)外顯子Taq酶切位點(diǎn)的基因突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例異常，在24號(hào)外顯子處喪失1個(gè)Taq 酶切位點(diǎn)。經(jīng)克隆測(cè)序證實(shí)，該患者F基因24號(hào)外顯子2209位密碼子發(fā)生突變，即CGATGA，使精氨酸變成終止密碼子。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)生在Taq 位點(diǎn)的基因

7、突變頻率大約占所有血友病A患者的3%6%，而我們的頻率約為1.4%，這種差異還有待于擴(kuò)大研究樣本來進(jìn)一步證實(shí)。國外已報(bào)道的該位點(diǎn)突變的24例血友病A患者中12例為精氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚?0例為精氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，而且絕大多數(shù)為重型病例。運(yùn)用PCR擴(kuò)增包含Taq 酶切位點(diǎn)(識(shí)別CG序列)區(qū)域，這對(duì)于血友病A基因缺陷的快速篩選不失為一種有效的定位方法。反過來，這些位點(diǎn)的突變也為CG雙核苷酸熱點(diǎn)突變提供了佐證。F基因熱點(diǎn)突變的研究，不僅有助于了解這些位點(diǎn)的基因突變頻率，而且也有利于開展快速的遺傳咨詢工作。作者單位：215006   蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、江蘇省血液研究所、蘇州醫(yī)學(xué)院血

8、栓與止血研究室參 考 文 獻(xiàn)1 Lavergne JM, Bahnak BR, Vidaud M, et al. A directed search for mutations in hemophilia A using restriction enzyme analysis and denaturing gradient gel electrophoresis: a study of seven exons in the factor gene of 170 cases. Nouv Rev Fr Hematol, 1992, 34:85-91.2 Pattinson JK,Millar DS

9、,McVey JH,et al.The molecular genetic analysis of hemophilia A: a directed search strategy for the detection of point mutations in the human factor gene. Blood, 1990，76:2242-2248.3 Tuddenham EGD, Schwaab R, Seehafer J, et al. Haemo-philia A: database of nucleotide substitutions, deletions, insertion

10、s and rearrangements of the factor gene. Nucl Acids Res, 1994, 22:3511.4 Gitschier J, Kogan S, Levinson B, et al. Mutations of factor cleavage sites in hemophilia A. Blood, 1988, 72:1022-1028.5 Gitschier J, Wood WI, Tuddenham EGD, et al. Detection and sequence of mutations in the factor gene of haem

11、ophiliacs. Nature, 1985, 315:427-430.6 Antonarakis SE, Waber PG, Kittur SD, et al. Hemophilia A: detection of molecular defects and carrier by DNA analysis. N Engl J Med, 1985, 313:842-848.7 Youssoufian H, Antonarakis SE, Aronis S, et al. Characterization of five partial deletions of the factor gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:3772-3776.8 Youssoufian H, Antonarakis SE， Bell W, et